96孔板微生物法測定血液中葉酸操作方法

96 孔板微生物學法微量測定葉酸是葉酸測定方法的重大改進, 這使測定時間大為縮短。原來試管法需時 36～48h，現縮短為 16～18h，而且這一方法更為精確、靈敏、簡便。 96孔板葉酸測定使用量更微，測試樣本量大、重復性好，適用于大批量樣本的檢測研究。下面介紹一種96孔板法測定血液中葉酸含量的操作方法[1]。

葉酸生長培養基

取4.7 g葉酸培養基加入到 100 mL蒸餾水中煮沸，冷卻后加入氯霉素 0.05 g、抗壞血酸0.75 g，每20 mL分裝于培養管中，保存于－80℃ 。

菌株

將 1 支凍干乳酸桿菌氯霉素耐藥株接種于20 mL葉酸生長培養基充分搖勻后，置于 37℃ 培養箱內培養24 h，取1 mL 接種于另一個20 mL 新鮮生長培基傳代培養，得到對數生長期的菌液，與 80% 的甘油等體積混合，每1 mL 分裝保存于 -80℃。

檢測培養基

稱取9.4g  Himedia葉酸測定用培養基（貨號：M543）干粉培養基溶于100mL蒸餾水，加入50mg抗壞血酸。加熱至沸騰使培養基完全溶解。測定時，分裝至每管為5mL培養基（包含標準品和待測樣品）。加蒸餾水，使總體積達到10mL。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻，臨用前加入氯霉素 0.03 g，抗壞血酸 0.75 g和 200μL 菌株。

標準曲線

取 100 μg / L 的葉酸標準液用0.5% 抗壞血酸鈉溶液 1∶200 稀釋，得到 0.5 μg/L 的標準工作液。在 96孔酶標板中1～12列分別加入標準工作溶液 0 μL、0 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、80 μL、100 μL，用0.5% 抗壞血酸鈉溶液定容至 100 μL，**列加入10 μL 的疊氮鈉溶液( 3% ) 作為空白對照。全板每孔加 150 μL Himedia葉酸測定用培養基，封膜，37℃厭氧培養42 h，采用免疫酶聯測定儀測定595 nm下吸光度(A)值。以葉酸濃度為自變量(X)濃度為(0、0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5)μg/L

，以乳酸桿菌生長后培養基 A 值為因變量(Y) 制作標準曲線。

( 5 )測定

將血漿標本用 0.5% 抗壞血酸鈉溶液40 倍稀釋，分別在 A1，A2，A3 孔加100 μL，在 B1，B2，B3 孔加 50 μL。B 行用 0.5% 抗壞血酸鈉溶液定容至 100 μL。A1，A2，B1，B2作為測定孔，A3，B3 孔加 10 μL疊氮鈉溶液( 3% ) 作為空白對照孔。每孔分別加入 150 μL Himedia葉酸測定用培養基，培養方法同上。測各樣本生長后的吸光度值，由標準曲線換算樣品中葉酸含量。

參考文獻

[1] 徐文婕，曲全岡，劉建蒙.微生物法檢測血漿葉酸實驗方法評價及應用. 中國衛生檢驗雜志[J] 2011 , 7 (21 ): 1722-1724.