藥品檢驗(yàn)用培養(yǎng)基的驗(yàn)證

當(dāng)一種品牌的培養(yǎng)基在某藥廠開始啟用的時(shí)候，一般先需要進(jìn)行驗(yàn)證。下面根據(jù)《中國藥典》2015年版，對(duì)驗(yàn)證方法進(jìn)行闡述。

一：無菌檢查

全過程應(yīng)無菌操作。環(huán)境的潔凈度應(yīng)符合無菌檢查的要求。

對(duì)無菌檢查用培養(yǎng)基的要求：干粉培養(yǎng)基加純水溶解并高壓滅菌后，溶液應(yīng)澄清，無沉淀。

培養(yǎng)基進(jìn)行無菌試驗(yàn)，應(yīng)無菌生長，還需靈敏度測試合格（已知試驗(yàn)菌株）。

培養(yǎng)基的適用性檢查：

1、無菌性檢查。2、靈敏度檢查

無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。

要點(diǎn)：空白培養(yǎng)，看是否長菌。

靈敏度檢查（簡要）：獲取特定菌種（如金葡、銅綠），制備菌液，使每ml含菌數(shù)小于100cfu。菌液在室溫應(yīng)2小時(shí)內(nèi)使用，在2-8度應(yīng)24小時(shí)內(nèi)使用。

?取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；

?取每管裝量為9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。

?結(jié)果判定：空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長，加菌的培養(yǎng)基管均生長良好。

要點(diǎn)：接種試驗(yàn)菌量小于100cfu，看是否生長，以觀察靈敏度。

方法的適用性檢查：

菌種與菌液制備同上。

薄膜過濾法：取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量，按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天。

直接接種法：取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管。取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對(duì)照，培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天。

結(jié)果判斷 與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢査。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

要點(diǎn)：用試驗(yàn)菌測試，看供試品中是否有抑菌物質(zhì)。如果有，則應(yīng)使用中和劑或者增加沖洗量。

二、微生物限度檢查

1）微生物計(jì)數(shù)法

方法分為平皿法（傾注法、涂布法）、薄膜過濾法、MPN法(最可能數(shù)法)。

MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。

培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)

制備試用菌液。設(shè)立陰性對(duì)照。

接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌液。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。

要點(diǎn)：使用“對(duì)照培養(yǎng)基”，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)近似。同時(shí)，接種試驗(yàn)菌液量不大于100CFU。

方法適用性試驗(yàn):

制備供試液。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。

(1)試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。

(2)供試品對(duì)照組 取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

(3)菌液對(duì)照組 取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加人試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

若有抗菌活性，則應(yīng)增加稀釋液或培養(yǎng)基體積，或加入適宜的中和劑或滅活劑以去除或滅活。

平皿法：取供試液1ml（傾注法），置90mm的無菌平皿中，注入15?20ml溫度不超過45°C熔化的TSA或SDA培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。同法測定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。若為涂布法，則供試液量不少于0.1ml。

薄膜過濾法：濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm，直徑一般為50mm。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。每張濾膜每次沖洗量一般為100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。濾膜菌面朝上培養(yǎng)基上培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。

MPN法：僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用。該法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。（略）

結(jié)果判斷

對(duì)于前兩法，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)；采用MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。

要點(diǎn)：存在三組即樣品+試驗(yàn)菌液、樣品+稀釋液、稀釋液+試驗(yàn)菌液。樣品中也含有菌。三組設(shè)定主要是為排除樣品對(duì)試驗(yàn)菌液生長的影響，近似Spike試驗(yàn)。“樣品+試驗(yàn)菌液”減去“樣品+稀釋液”，應(yīng)接近“稀釋液+試驗(yàn)菌液”的情況，才算合格。

2）控制菌檢查法

如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

培養(yǎng)基適用性檢查（使用對(duì)照培養(yǎng)基，還需制備試驗(yàn)用的陽性菌株）。

菌種及菌液制備

設(shè)陰性對(duì)照，應(yīng)無菌生長

培養(yǎng)基進(jìn)行促生長能力、抑制能力及指示特性的檢査。如下表。

促生長能力和指示特性檢查：接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌

抑制能力檢查：接種不小于100cfu的試驗(yàn)菌

控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)

供試液制備

試驗(yàn)菌液制備

取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；

采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，過濾后，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。

結(jié)果判斷

上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，則合格；若未檢出試驗(yàn)菌，則應(yīng)消除供試品的抑菌活性，并重新試驗(yàn)。如果經(jīng)過試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。

要點(diǎn)：看試驗(yàn)菌液能否檢出。在最后一次沖洗液中加入。能檢出即為合格。

三、培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)

此條依據(jù)食藥監(jiān)局發(fā)布的《無菌工藝模擬試驗(yàn)指南（無菌制劑）》征求意見稿。

“確保滅菌后培養(yǎng)基的促生長能力，避免過度滅菌使培養(yǎng)基碳化造成其促生長性能的降低。為避免過度加熱可采用濕熱滅菌與除菌過濾聯(lián)合使用的方式，但均應(yīng)進(jìn)行促生長能力試驗(yàn)。”

“6.3.5.1. 應(yīng)在無菌工藝模擬試驗(yàn)前及14天培養(yǎng)后按照現(xiàn)行中國藥典方法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行促生長能力試驗(yàn)。

6.3.5.2. 促生長能力試驗(yàn)使用的菌種包括：白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢桿菌（CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、銅綠假單胞菌（CMCC10104）和生孢梭菌（CMCC64941）等。除標(biāo)準(zhǔn)菌株之外，還應(yīng)考慮加入環(huán)境和無菌檢查中發(fā)現(xiàn)的典型微生物。促生長試驗(yàn)接種量應(yīng)不大于100CFU，按照中國藥典要求培養(yǎng)，以證明培養(yǎng)基能夠支持微生物的生長。”

“其它模擬介質(zhì)的評(píng)價(jià)

  在使用模擬介質(zhì)前應(yīng)對(duì)其適用性進(jìn)行確認(rèn)，包括無菌試驗(yàn)、抑菌試驗(yàn)、溶解度試驗(yàn)等。抑菌試驗(yàn)通常使用枯草芽孢桿菌（CMCC63501）和白色念珠菌（CMCC98001）。除此之外，還應(yīng)考慮加入環(huán)境和無菌檢查中發(fā)現(xiàn)的典型微生物。無菌模擬介質(zhì)由無菌注射用水分散，然后加入到無菌培養(yǎng)基中，達(dá)到模擬工藝選用的濃度范圍。然后在每份培養(yǎng)基中接種10-100CFU。陽性對(duì)照接種到不含無菌模擬介質(zhì)的試管中，在20-25℃培養(yǎng)7天所有試管應(yīng)明顯渾濁。”