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Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)

2018-12-17 09:01來(lái)源:締一生物


大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已被廣泛用于生物制品的加工和生產(chǎn)。同時(shí),無(wú)血清和無(wú)動(dòng)物源成分的培養(yǎng)基也成為生物制品發(fā)展的必然方向。其工藝的研發(fā)和優(yōu)化成為工業(yè)生產(chǎn)成功的關(guān)鍵。它應(yīng)最有利于細(xì)胞生長(zhǎng),并有利于其收獲病毒或表達(dá)目的產(chǎn)物。


Vero細(xì)胞是常用的疫苗生產(chǎn)細(xì)胞之一。它的無(wú)血清培養(yǎng)基主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加因子兩大部分組成1。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,最重要的營(yíng)養(yǎng)成分是葡萄糖和谷氨酰胺。葡萄糖是細(xì)胞生長(zhǎng)增殖以及產(chǎn)物表達(dá)過(guò)程中重要的能量來(lái)源。谷氨酰胺是氮源、碳源和能量來(lái)源,它還為細(xì)胞提供蛋白質(zhì)和氨基酸的前體物質(zhì)。據(jù)估計(jì),細(xì)胞所需能量的30%~65%都來(lái)自于谷氨酰胺的代謝。但是過(guò)高濃度的葡萄糖和谷氨酰胺會(huì)引起培養(yǎng)基中乳酸及氨等代謝產(chǎn)物的堆積而損害細(xì)胞。Vero 細(xì)胞常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有M199、DMEM和F12。但這里推薦一款改良型的M199培養(yǎng)基——SFRE 199。它的歷史也不短,早在幾十年前即用于狒狒腎原代細(xì)胞的培養(yǎng)。和M199相比,SFRE 199升高了葡萄糖的濃度以及8種氨基酸的濃度(精氨酸-鹽酸、半胱氨酸、胱氨酸、L -谷氨酰胺、L -谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、酪氨酸),并加入硫酸鋅、丙酮酸鈉和魚(yú)精蛋白鋅胰島素,但硝酸鐵、黃嘌呤和碳酸氫鈉的濃度降低。它還添加了半乳糖,以避免乳酸過(guò)度積累。研究表明,SFRE 199可減少小牛血清的用量或根本不用添加牛血清,而并不降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。后來(lái)發(fā)現(xiàn),歐美將之用于Vero細(xì)胞的貼壁培養(yǎng),效果很好,病毒增殖速度也較高2。但需注意,SFRE 199培養(yǎng)基(HiMedia公司生產(chǎn))不含胰島素和碳酸氫鈉,需在使用前單獨(dú)添加。


Vero細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基還需要有一些添加因子。曾有機(jī)構(gòu)通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素,人轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的影響較大3。因此,上述三種成分必不可少。


此外,Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)還需要一定量的其他激素,如多肽類激素中的生長(zhǎng)素、胰高血糖素、甲狀腺素等以及甾類激素中的孕酮、氫化可的松和雌二醇等。在Vero細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中,研究者常常加入皮質(zhì)醇等激素來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基成分。


在Vero細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)中,常用的細(xì)胞生長(zhǎng)因子是EGF和FGF。有人在研究微載體無(wú)血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)認(rèn)為EGF更能夠促進(jìn)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)。


培養(yǎng)基中還需要含有促貼壁因子,如纖連蛋白、膠原蛋白和多聚賴氨酸等成分,這些因子除具有促進(jìn)細(xì)胞貼壁延伸的作用外,還能促進(jìn)細(xì)胞的分化。


培養(yǎng)基中需要添加的微量元素則有亞硒酸鈉和鋅。維生素則需含有維生素C、維生素E和生物素。維生素C和維生素E具有抗氧化作用。生物素是一些特異羧化酶的組成部分,參與糖代謝和脂肪酸的合成過(guò)程。另外,關(guān)于Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的報(bào)道中,幾乎都添加了乙醇胺,它作為一種還原劑,可以穩(wěn)定細(xì)胞膜。也有的在培養(yǎng)基中添加丙酮酸鈉和β-巰基乙醇。丙酮酸鈉是碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物,可以為細(xì)胞增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。β-巰基乙醇可以改善細(xì)胞的存活率。


國(guó)家食藥監(jiān)局曾宣布Vero細(xì)胞培養(yǎng)基不作為醫(yī)療器械管理的產(chǎn)品,因此給了每個(gè)機(jī)構(gòu)足夠的開(kāi)發(fā)空間。


締一生物作為HiMedia公司在中國(guó)的代理商,提供HiMedia生產(chǎn)的SFRE 199培養(yǎng)基(干粉型)——一款M199培養(yǎng)基的改良型。它作為Vero細(xì)胞培養(yǎng)液的基礎(chǔ)成分具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。


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參考文獻(xiàn)


1. 蘇曉蕊、岳華、湯承. Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基研究進(jìn)展. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2012, 33(2):87-90


2. Jack Litwin. The growth of Vero cells as suspended aggregates in serum-free medium.Animal Cell Technology, 1992: 414-417


3. 段盼盼, 等. Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)化. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志. 2015, 28(5):518-522