Vero細胞無血清培養基的開發

大規模動物細胞培養已被廣泛用于生物制品的加工和生產。同時，無血清和無動物源成分的培養基也成為生物制品發展的必然方向。其工藝的研發和優化成為工業生產成功的關鍵。它應最有利于細胞生長，并有利于其收獲病毒或表達目的產物。

Vero細胞是常用的疫苗生產細胞之一。它的無血清培養基主要由基礎培養基和添加因子兩大部分組成1。在基礎培養基中，最重要的營養成分是葡萄糖和谷氨酰胺。葡萄糖是細胞生長增殖以及產物表達過程中重要的能量來源。谷氨酰胺是氮源、碳源和能量來源，它還為細胞提供蛋白質和氨基酸的前體物質。據估計，細胞所需能量的30％～65％都來自于谷氨酰胺的代謝。但是過高濃度的葡萄糖和谷氨酰胺會引起培養基中乳酸及氨等代謝產物的堆積而損害細胞。Vero 細胞常用的基礎培養基有Ｍ199、DMEM和F12。但這里推薦一款改良型的M199培養基——SFRE 199。它的歷史也不短，早在幾十年前即用于狒狒腎原代細胞的培養。和M199相比，SFRE 199升高了葡萄糖的濃度以及8種氨基酸的濃度（精氨酸-鹽酸、半胱氨酸、胱氨酸、L -谷氨酰胺、L -谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、酪氨酸），并加入硫酸鋅、丙酮酸鈉和魚精蛋白鋅胰島素，但硝酸鐵、黃嘌呤和碳酸氫鈉的濃度降低。它還添加了半乳糖，以避免乳酸過度積累。研究表明，SFRE 199可減少小牛血清的用量或根本不用添加牛血清，而并不降低細胞的生長速率。后來發現，歐美將之用于Vero細胞的貼壁培養，效果很好，病毒增殖速度也較高2。但需注意，SFRE 199培養基（HiMedia公司生產）不含胰島素和碳酸氫鈉，需在使用前單獨添加。

Vero細胞的無血清培養基還需要有一些添加因子。曾有機構通過試驗設計方法優化Vero細胞無血清培養基，結果發現胰島素，人轉鐵蛋白和牛血清白蛋白對Vero細胞生長的影響較大3。因此，上述三種成分必不可少。

此外，Vero細胞的生長還需要一定量的其他激素，如多肽類激素中的生長素、胰高血糖素、甲狀腺素等以及甾類激素中的孕酮、氫化可的松和雌二醇等。在Vero細胞的無血清培養過程中，研究者常常加入皮質醇等激素來優化培養基成分。

在Vero細胞的無血清培養中，常用的細胞生長因子是EGF和FGF。有人在研究微載體無血清動物細胞培養時認為EGF更能夠促進Vero細胞的生長。

培養基中還需要含有促貼壁因子，如纖連蛋白、膠原蛋白和多聚賴氨酸等成分，這些因子除具有促進細胞貼壁延伸的作用外，還能促進細胞的分化。

培養基中需要添加的微量元素則有亞硒酸鈉和鋅。維生素則需含有維生素C、維生素E和生物素。維生素C和維生素E具有抗氧化作用。生物素是一些特異羧化酶的組成部分，參與糖代謝和脂肪酸的合成過程。另外，關于Vero細胞無血清培養基的報道中，幾乎都添加了乙醇胺，它作為一種還原劑，可以穩定細胞膜。也有的在培養基中添加丙酮酸鈉和β-巰基乙醇。丙酮酸鈉是碳水化合物代謝的中間產物，可以為細胞增加營養物質。β-巰基乙醇可以改善細胞的存活率。

國家食藥監局曾宣布Vero細胞培養基不作為醫療器械管理的產品，因此給了每個機構足夠的開發空間。

締一生物作為HiMedia公司在中國的代理商，提供HiMedia生產的SFRE 199培養基（干粉型）——一款M199培養基的改良型。它作為Vero細胞培養液的基礎成分具有獨特的優勢。

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參考文獻

1. 蘇曉蕊、岳華、湯承. Vero細胞無血清培養基研究進展. 動物醫學進展. 2012, 33(2):87-90

2. Jack Litwin. The growth of Vero cells as suspended aggregates in serum-free medium.Animal Cell Technology, 1992: 414-417

3. 段盼盼, 等. Vero細胞無血清培養基的優化. 中國生物制品學雜志. 2015, 28(5)：518-522