DNA和RNA復(fù)制變得簡(jiǎn)單 通用等溫DNA擴(kuò)增方法

無(wú)論是揭示具有DNA證據(jù)的犯罪者，診斷病原體，對(duì)古生物學(xué)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行分類，還是確定親子關(guān)系，核酸的重復(fù)(擴(kuò)增)都是必不可少的。

在Angewandte Chemie期刊中，科學(xué)家們現(xiàn)在推出了一種新的，非常簡(jiǎn)單但高度靈敏且可靠的方法，避免了通常的加熱和冷卻步驟，以及復(fù)雜的儀器。試劑可以冷凍干燥，這種通用方法可以在實(shí)驗(yàn)室外使用。

最常用的擴(kuò)增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，它基于對(duì)功率需求高的特殊儀器中多次熱循環(huán)的重復(fù)。例如，難以在實(shí)驗(yàn)室外，患者床邊或遠(yuǎn)程位置執(zhí)行。沒(méi)有熱循環(huán)的替代方法通常是復(fù)雜的或不夠靈敏，需要昂貴的試劑，或者不是廣泛適用的。

與中國(guó)上海華東理工大學(xué)的Bin-Cheng Yin和Bang-Ce Ye合作的研究人員現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出一種新的，廉價(jià)的方法：稱為基于Cas9n的擴(kuò)增反應(yīng)(Cas9nAR)，它由一個(gè)單一組成在均相溶液中進(jìn)行，并在37℃的恒定溫度下進(jìn)行。

在這種方法中，研究人員使用來(lái)自細(xì)菌“免疫系統(tǒng)”的成分。例如，當(dāng)細(xì)菌被病毒感染時(shí)，它們將外來(lái)遺傳物質(zhì)切成小塊并將它們引入它們自己基因組的特定區(qū)域。在隨后感染的情況下，細(xì)菌的RNA鏈“識(shí)別”這些序列并指導(dǎo)特殊的“遺傳剪刀”來(lái)切割外源DNA。這些工具也被用于現(xiàn)代基因工程。

Yin，Ye和他們的同事改變了稱為Cas9的遺傳剪刀，使其不再完全切斷DNA。相反，它只穿過(guò)一條線，引入了“缺口”。這種酶被稱為“切口酶”。與細(xì)菌系統(tǒng)一樣，Cas9切口酶與RNA鏈結(jié)合，這決定了切口的位置。例如，可以制備該RNA，使其識(shí)別病原體特征的DNA序列。然后Cas9切口酶切割緊鄰的DNA。

對(duì)于這項(xiàng)新技術(shù)，研究人員制作了兩種不同的Cas9切口酶RNA復(fù)合物，它們?cè)趦蓚€(gè)不同的位置切割DNA。通常用于PCR的聚合酶(exo(?)Klenow聚合酶)從**個(gè)切口開(kāi)始補(bǔ)充切割鏈，逐條地設(shè)置舊鏈，直到它到達(dá)第二個(gè)切口。新完成的DNA被切口酶復(fù)合物反復(fù)切口并補(bǔ)充。該過(guò)程釋放的短單鏈成為在第二個(gè)循環(huán)中進(jìn)一步擴(kuò)增的起點(diǎn)。除了切口酶復(fù)合物和聚合酶之外，**需要的是兩個(gè)合適的引物作為拷貝的起始點(diǎn)。

用細(xì)菌基因組DNA片段進(jìn)行的測(cè)試表明，靶序列被精確識(shí)別和擴(kuò)增。在20μl的體積中，可以檢測(cè)單個(gè)分子。可以以高特異性檢測(cè)基因內(nèi)單個(gè)核苷酸的差異。