制藥企業潔凈室的污染源及鑒定

制藥企業潔凈室的微生物污染源及鑒定

制藥企業潔凈室常需進行環境微生物的監控，以確保生產環境的潔凈以及不會造成藥品的污染。制藥企業潔凈室常見的污染源如下（據中國食品藥品檢定研究院在2018年全國藥品微生物檢驗控制技術精要培訓班上的講座ppt）：

1、人。攜帶的微生物主要有：金葡、表葡、八疊球菌、不動桿菌、產堿桿菌、親脂性酵母、皮膚真菌等。

2、空氣。攜帶的微生物主要有：微球菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌、曲霉、青霉。

3、設備、墻面、地面表面。存留的微生物主要有：假單胞菌、表葡、芽孢桿菌等。

4、原材料及包裝材料。攜帶的微生物有：乳桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈球菌、梭菌、霉菌（枝孢屬、青霉屬、曲霉屬）。

5、水。水中的微生物主要有：假單胞菌、產堿桿菌、寡養單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、皮氏伯克霍爾德菌、甲基桿菌屬、沙雷氏菌、黃桿菌等。

許多企業為了鑒定菌種，常將大量資金用于微生物全自動鑒定儀器和相關試劑的購買。其實，一些微生物生化鑒定試劑盒（無須軟件和儀器）、鑒別培養基和PCR試劑盒即可完成常見菌種的鑒定工作。

對于以上紅色標出的菌種或菌屬，已知均可用HiMedia生產的生化鑒定試劑盒去作鑒定。其生化鑒定試劑盒包含有生化鑒定卡及輔助試劑，每個生化鑒定卡上有12個孔，預置相關的培養基和生化試劑，對應12種生化反應。反應完成后，通過試劑盒內提供的結果詮釋表和菌種標準表，即可人工完成菌種鑒定。其試劑盒覆蓋大部分常見菌種，準確度高，在歐盟和美國FDA均有產品注冊。

上面的常見菌群中，金葡、表葡可用葡萄球菌的生化鑒定試劑盒（貨號KB004）進行鑒定，不動桿菌、芽孢桿菌、乳桿菌、鏈球菌均有相應的生化鑒定試劑盒。假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌可用非發酵菌生化鑒定試劑盒（貨號KB019）進行鑒定。沙雷氏菌屬于腸桿菌科，可用腸桿菌科的生化鑒定試劑盒（貨號KB003）進行鑒定。

對于黃色部分的菌種：寡養單胞菌，又稱嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，舊名“嗜麥芽假單胞菌”。它和皮氏伯克霍爾德菌、黃桿菌均可用非發酵菌試劑盒進行鑒定。

對于藍色部分的菌種：

1、微球菌屬。最常見為藤黃微球菌（Micrococcus luteus）。其為革蘭氏陽性，與葡萄球菌近似，菌落光滑，顏色呈黃或紅色。為條件致病菌，廣泛存在于自然界?！恫苁霞毦b定手冊》指出，其接觸酶陽性，無運動性，可利用乙酸鹽、乳酸鹽和丙酸鹽，不產生吲哚。依據生化特征鑒別藤黃微球菌時，主要依據其在含糖的復雜培養基上好氧的生長而不產生可察覺的酸。其菌落呈黃色、黃綠色或橙色。具體鑒定，可采用如下方案：1）先革蘭氏染色，觀察鏡下形態，如為球形，革蘭陽性，且疑為葡萄球菌或微球菌。2）可采用“葡萄球菌和微球菌發酵培養基”（英文名Fermentation HiVeg Medium for Staphylococcus and Micrococcus，貨號#MV827），以區分微球菌和葡萄球菌。其原理是，培養基中包含葡萄糖，葡萄球菌能厭氧產酸，而微球菌不能。培養基含有的溴甲酚紫為pH指示劑，可指示產酸帶來的pH變化。該液體培養基含有少量瓊脂，因而創造出厭氧環境。培養18-24小時后，如果是藤黃微球菌，則反應管沒有顏色變化，而葡萄球菌的管變為金黃色。

2、八疊球菌屬：屬于消化球菌科，細胞球形，呈八個或更多細胞的立方堆狀。可形成芽孢，革蘭陽性?？砂l酵葡萄糖，產酸，專性厭氧，在pH1到9.8均可生長。無接觸酶。鏡下應不難辨認。

對于產堿桿菌，它與產堿假單胞菌非常近似，它的鑒別特征是在含有蛋白胨的肉湯培養基中產氨，使pH上升。糞產堿桿菌最常見，它在碳水化合物培養基上呈強烈的產堿反應。木糖氧化產堿桿菌使OF葡萄糖培養基和OF木糖培養基產酸。本菌能還原亞硝酸鹽，而不能還原硝酸鹽。因而，采用OF基礎培養基（英文名：OF Basal HiVegTM Medium，貨號MV395）和相應的糖溶液可鑒別產堿桿菌。

對于棒狀桿菌，它屬于革蘭氏陽性大桿菌，接觸酶陽性。可采用碲酸鹽血瓊脂平板進行分離培養，棒狀桿菌菌落呈灰黑色。

對于甲基桿菌，可采用PCR 法擴增菌株的16S rDNA 和甲醇脫氫酶大亞基的 mxaF 基因，擴增產物進行測序，在NCBI數據庫中用BLAST 進行比對，并用MEGA4.0軟件進行系統進化樹分析。甲基桿菌為革蘭陰性，氧化酶和接觸酶陽性。

對于梭菌，大部分為嚴格厭氧菌。在《伯杰細菌鑒定手冊》中給出了一個表，主要根據糖發酵來鑒定梭菌屬內的各個菌種。HiMedia公司提供了一種包含35種糖發酵的試劑盒（貨號KB009），因而可用于梭菌的鑒定。

對于真菌，如親脂性酵母和霉菌（枝孢屬、青霉屬、曲霉屬），首先從形態上可區分細菌，也可區分酵母和霉菌，霉菌常常有絲狀菌絲。不同霉菌，有些從形態上也可區分。青霉菌屬帚狀枝是根據青霉菌屬特征性結果，根據菌落特征、分生孢子梗、帚狀枝、瓶梗和分生孢子形態特征，就可鑒定到屬甚至種水平。曲霉具有有隔菌絲、分生孢子梗和特殊的分生孢子頭結構，易與其他菌屬真菌區別。還可根據SDA或PDA平板上生長的快慢、菌落形態、分生孢子梗等進一步鑒別。HiMedia也提供了一款鑒別培養基，貨號M1127，可區分巴西曲霉、黃曲霉和寄生曲霉。

總之，對于制藥企業潔凈室的常見菌，通過形態染色、生化鑒定（可采用市面上提供的生化鑒定試劑盒）、PCR產物測序等手段，已足以滿足鑒定的需求，從而完成溯源和診斷的任務。