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【支原體核酸法】用絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品

2020-08-19 13:45來(lái)源：威正翔禹|締一生物


目前，支原體核酸檢測(cè)法（常規(guī)PCR、熒光定量PCR）應(yīng)用較為廣泛，尤其在生物制藥和細(xì)胞治療領(lǐng)域，可以替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和DNA染色法。但同時(shí)，各種品牌的支原體PCR和qPCR檢測(cè)試劑盒又良莠不齊，因此，對(duì)核酸法本身進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證是非常必要的。


國(guó)際上對(duì)支原體核酸法的驗(yàn)證提出了三項(xiàng)要求：檢測(cè)限、特異性和耐用性。在檢測(cè)限方面，歐洲藥典除了規(guī)定要達(dá)到10CFU/ml或100CFU/ml外，也指出可以用等量的支原體核酸拷貝數(shù)來(lái)表示。這時(shí)就需要選用合適的支原體核酸標(biāo)準(zhǔn)品。


全球知名的微生物污染防控公司Minerva Biolabs（以下簡(jiǎn)稱(chēng)德國(guó)MB公司），專(zhuān)門(mén)提供包括歐洲/日本藥典指定9種支原體在內(nèi)的PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品共14種，可進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)苽錁?biāo)準(zhǔn)曲線，確定核酸法的檢測(cè)限，因而廣受全球藥廠的青睞。

德國(guó)MB公司提供的PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品信息如下：

德國(guó)MB公司提供的PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品信息如下：

PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的物種

貨號(hào)

口腔支原體

52-0112

雞敗血支原體

52-0115

萊氏無(wú)膽甾原體

52-0116

發(fā)酵支原體

52-0117

肺炎支原體

52-0119

關(guān)節(jié)液支原體

52-0124

精氨酸支原體

52-0129

豬鼻支原體

52-0130

檸檬螺原體

52-0164

唾液支原體

52-0103

百日咳桿菌

52-5571

大腸埃希菌

52-0083

嗜肺軍團(tuán)菌

52-0101

銅綠假單胞菌

52-0071




一、試劑盒組分：

試劑盒組分

數(shù)量

蓋子顏色

PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品

1×108基因組拷貝/管

1管凍干粉

綠色

Tris緩沖液，10mM Tris，pH8.5（用于溶解和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品）

2ml×3管

白色


說(shuō)明：2-8℃保存。使用前，標(biāo)準(zhǔn)品溶解后在-18℃以下保存。避免反復(fù)凍融。


、質(zhì)控保證


微生物在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期收集。DNA用酚氯仿抽提，繼而用過(guò)濾柱純化。DNA純度用分光光度計(jì)法測(cè)量，保證OD260/280≥1.8。微生物物種用Sanger測(cè)序法確定。


純化DNA的定量采用小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行光密度測(cè)量，進(jìn)而用熒光法證實(shí)。DNA最終稀釋?zhuān)⒄{(diào)整為1×108基因組拷貝/管。稀釋倍數(shù)用qPCR分析證實(shí)。

每個(gè)批號(hào)的產(chǎn)品均提供質(zhì)控證明。

三、操作步驟：

1、標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶

（1）所有管短時(shí)離心。

（2）加入100μl Tris緩沖液到帶綠蓋的管中。

（3）室溫靜置5分鐘。

（4）渦旋振蕩10秒，再離心5秒。

（5）使用適當(dāng)體積的DNA溶液直接用于PCR或直接稀釋?zhuān)糜谥苽銬NA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2、制備10倍稀釋的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

（1）使標(biāo)準(zhǔn)品和Tris緩沖液室溫達(dá)到平衡。

（2）標(biāo)記每個(gè)1.5ml離心管。每個(gè)管加入90ml Tris緩沖液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品混勻離心。

（4）標(biāo)準(zhǔn)品1：加10μl標(biāo)準(zhǔn)品母液到第1管，蓋蓋并混勻。簡(jiǎn)要離心。

（5）標(biāo)準(zhǔn)品2：從第1管中取出10μl到第2管，蓋蓋并混勻。簡(jiǎn)要離心。

（6）標(biāo)準(zhǔn)品3：從第2管中取出10μl到第3管，蓋蓋并混勻。簡(jiǎn)要離心。

（7）下面的管均重復(fù)以上步驟。推薦制備6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（梯度稀釋?zhuān)?/span>

3、PCR擴(kuò)增

溶解的DNA可直接用于常規(guī)PCR。德國(guó)MB公司推薦Venor?GeM PCR試劑盒用于支原體檢測(cè)，或Onar?

Bacteria PCR試劑盒用于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)菌檢測(cè)。

對(duì)于qPCR，使用梯度稀釋的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，可制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。大多數(shù)qPCR軟件允許通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。這依賴(lài)于正確的設(shè)置，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)。為便于正確定量，要確定你的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。使用者可以試用下列參數(shù)用于設(shè)置。體積決定了每個(gè)PCR反應(yīng)的基因組拷貝數(shù)。


反應(yīng)管編號(hào)

2μl樣品

5μl樣品

10μl樣品

1

2×105基因組拷貝

5×105基因組拷貝

1×106基因組拷貝

2

2×104基因組拷貝

5×104基因組拷貝

1×105基因組拷貝

3

2×103基因組拷貝

5×103基因組拷貝

1×104基因組拷貝

4

200基因組拷貝

500基因組拷貝

1000基因組拷貝

5

20基因組拷貝

50基因組拷貝

100基因組拷貝

6

2基因組拷貝

5基因組拷貝

10基因組拷貝


4、評(píng)估

使用梯度稀釋?zhuān)琿PCR檢測(cè)后Ct值會(huì)隨著DNA濃度下降而升高。通過(guò)Ct值和DNA樣本量產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知樣本的濃度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算。下列的擴(kuò)增曲線是用德國(guó)MB公司的Venor?

GeM qEP試劑盒繪制的。所用儀器為CFX96 Touch熒光定量PCR儀。

圖1. 梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。標(biāo)準(zhǔn)品為發(fā)酵支原體的106至10個(gè)基因組拷貝數(shù)。

圖2.用Bio-Rad CFX Manager軟件產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總之，PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品可提供低拷貝數(shù)的DNA標(biāo)準(zhǔn)品，因而可精準(zhǔn)確定核酸法的檢測(cè)限。而10CFU的靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品只能觀察是否能達(dá)到這一閾值，而無(wú)法確定最終為多少。從這個(gè)角度說(shuō)，PCR絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品具有自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。