|
支原體標準品在核酸法驗證中的應用2020-08-25 15:38來源:威正翔禹|締一生物
支原體核酸法是通過檢測支原體的特異核酸序列,以確定細胞上清或生物制品中是否存在支原體污染的一種方法。由于它具有檢測時間短(只需3-4h)、操作便捷等特點,越來越受到生物制品企業的青睞。 支原體核酸法包括PCR和qPCR,可作為藥典規定的培養法或DNA染色法的替代方法,或與以上方法相互補充。事實上,早在2011年,就有動物疫苗廠家在2011年第5期的《廣東農業科學》上,報道了用德國Minerva Biolabs(簡稱MB)公司的支原體PCR試劑盒,用于檢測疫苗中是否存在支原體的污染,它可與培養法互為補充,共同用于生產,為生產提供可靠的數據支持。 但支原體核酸法在用于放行檢測之前,需先進行方法驗證。歐洲藥典和日本藥典均要求核酸法需要在靈敏度、特異性和耐用性三個指標方面達到要求。 例如,在靈敏度方面(又稱最低檢測限),要求核酸法替代培養法,則靈敏度需達到10CFU/ml;核酸法替代DNA染色法,則靈敏度需達到100CFU/ml。 在特異性方面,歐洲藥典和日本藥典要求,核酸法要識別指定的常見9種支原體,而不識別與支原體有近緣關系的菌屬,如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳桿菌和肺炎鏈球菌,也不識別其他細菌和哺乳動物DNA。 在耐用性方面,歐洲藥典要求檢測結果不受方法參數的小的偏差的影響,如濃度的變化(MgCl2、引物、dNTP)、提取步驟的細微差別等。實際上這是強調結果的可靠性和穩定性,不受人為操作誤差的影響。這可通過3輪不同時間段內的檢測來實現,每輪進行8次重復檢測,最后觀察結果有什么變化。 在進行方法驗證時,參比標準品是必不可少的。世界**微生物防控專家德國MB公司提供有一系列的支原體標準品和支原體DNA標準品,用于支原體核酸法的方法學驗證。 圖. MB公司提供的10CFUTM支原體套裝 MB提供的標準品有三類:一類是靈敏度標準品,它同時也用于耐用性驗證。該標準品為凍干粉型的滅活支原體,這樣不會造成實驗室污染。原支原體來自英國NCTC菌種保藏中心,由于傳代次數低,也很少發生突變。支原體經標準定量,有10CFU/管和100CFU/管可選。使用時用1ml與待測樣本同樣的基質液去溶解。之后進行支原體DNA抽提,再進行核酸法檢測。如結果陽性,則表明最低檢測限能達到上述標準。 MB公司第二類標準品為特異性驗證用標準品,它包括支原體基因組DNA以及細菌基因組DNA,種屬經測序驗證。該標準品為10ng左右包裝,為凍干粉型。 第三類標準品是經過嚴格定量的支原體DNA標準品,每管支原體基因組DNA的量為1×108基因組拷貝,用于10倍梯度稀釋制備標準曲線,以對核酸法(主要是qPCR)的檢測限進行精確定量,并可驗證標準品濃度對數與Ct值的線性關系。 圖. 肺炎支原體DNA的定量。模板DNA的范圍為2X105-2個拷貝數基因組 值得指出的是,歐洲藥典和日本藥典均要求先進行支原體DNA抽提,再進行核酸法檢測。因此,方法驗證實際上包括了核酸法的這兩部分。 對于生物制品、細胞治療產品的生產企業,在選用已經過廠家全面驗證的支原體檢測試劑盒之外,還需自己按照待測樣本類型進行方法的適用性驗證。因為試劑盒的驗證并不能代替包括操作過程在內的方法的適用性,操作、樣本基質和儀器同樣會對核酸法的技術指標產生不可忽視的影響。 如您對德國MB公司的支原體標準品或檢測試劑盒感興趣,歡迎聯系MB公司中國區總代理上海威正翔禹生物或北京締一生物科技有限公司。 具體信息如下: 北京締一生物網址:www.dyshengwu.com 上海威正翔禹網址:www.klyyp.com QQ: 1580434811 QQ: 1258888686 電話:400-166-8600 電話:010-84118494 技術支持:021-64186645 投訴建議:13817972641 郵箱:servicebj@viansaga.com 郵箱:servicesh@viansaga.com 德國MB公司簡介: 德國MB公司,全稱Minerva Biolabs,是世界**的微生物污染控制公司,成立于1999年,總部位于德國柏林。MB公司具有ISO 9001和ISO 13485體系認證。 公司創始人來自于全球聞名的羅伯特?科赫微生物研究所。 二十年來,MB公司專注于微生物污染檢測與清除, 特別是支原體和軍團菌的技術和產品,在世界上遙遙領先。 ?自1999年起即研發細胞培養和生物藥工業用QC檢測試劑 ?配備生物安全二級實驗室 ?GMP級潔凈車間生產 ?世界**的支原體PCR檢測試劑供應商 ?IOM和PDA成員 ?ISO 9001和ISO 13485認證 注:IOM全稱Institute of Medicine PDA全稱Parenteral Drug Association 2007年,上海威正翔禹生物科技有限公司作為MB公司的全國總代理,將支原體檢測防控的優秀產品引入中國。十幾年來,不斷為中國生物研究實驗室,以及眾多生物制藥企業,提供了完整高效的支原體等微生物檢測及祛除解決方案。 上一篇: 選購胎牛血清要點解析
下一篇: 簡單介紹透析胎牛血清應用
|