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『支原體qPCR檢測』的方法學驗證

2020-12-29 15:39來源：威正翔禹|締一生物

在生物制品和細胞治療領(lǐng)域，支原體檢查是保證產(chǎn)品和治療安全的重要一環(huán)。生物源性原材料、采用細胞培養(yǎng)技術(shù)制備的疫苗、抗體，以及細胞或基因治療產(chǎn)品在生產(chǎn)過程的不同階段都要進行支原體污染的檢查。

傳統(tǒng)支原體檢查方法是培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法，并為藥典所認可和收錄。近年來，『支原體qPCR檢測』在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，但在項目申報前，先需要進行方法學驗證，依據(jù)藥典，在檢測限、特異性和耐用性方面達到要求后，才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。


就筆者所知，在適合工業(yè)的支原體檢測和方法驗證方面，德國Minerva Biolabs（簡稱MB）公司已有很成熟的產(chǎn)品及商業(yè)化應(yīng)用，它不僅提供有符合國際藥典的『支原體qPCR檢測』試劑盒，而且有一系列支原體標準品及輔助產(chǎn)品，用于qPCR方法的全面驗證。這些產(chǎn)品性價比也較高，全球許多客戶都在使用。


下面，筆者就『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』的方法驗證產(chǎn)品闡述如下。

一、『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求


各國藥典對支原體核酸擴增檢測方法（簡稱NAT法）的驗證要求略有出入，但均要求對最低檢出限、特異性和耐用性進行驗證。在檢測方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進行支原體檢測。


如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產(chǎn)商提供完整的方法學驗證數(shù)據(jù)外，還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性，以及試劑盒表現(xiàn)出預(yù)期的性能（例如檢測限、耐用性、是否存在與細菌的交叉反應(yīng)）。這些必須由使用者自己來證明。


在最低檢出限驗證中，歐洲藥典（簡稱EP）規(guī)定了污染細胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養(yǎng)法，對這9種支原體的檢測限需均達到10CFU/ml。其中如果生產(chǎn)中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關(guān)節(jié)液支原體（M. synoviae）。


日本藥典（簡稱JP）中的驗證要求與EP基本一致，但在最低檢出限驗證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗證。


最終待驗證的支原體物種的選擇，在依據(jù)藥典基礎(chǔ)上，還需根據(jù)支原體污染風險大小而定。污染風險的影響因素有支原體寄生的宿主細胞的特異性、原材料的來源、產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域等。


德國MB公司提供有10CFUTM支原體高敏標準品，可同時用于檢測限和耐用性的驗證。

關(guān)于檢測限和耐用性的檢測次數(shù)，有如下公式可參考：

檢測次數(shù) = 支原體物種數(shù) × 3 輪獨立檢測 × 8個復(fù)孔/每個物種/每輪


以歐洲藥典規(guī)定的9種支原體為例，實際所需檢測次數(shù)為9 × 3 × 8 = 216 次檢測。


加上陰性對照、陽性對照、無模板對照以及特異性驗證，預(yù)計規(guī)格為250次/盒的試劑盒較為適合。


在NAT法的特異性驗證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系，應(yīng)優(yōu)先選擇進行驗證。


至于更具體的驗證方案，還需要使用者針對自己的產(chǎn)品以及流程自行設(shè)計，德國MB公司也可協(xié)助完善。



二、德國MB公司提供的『支原體qPCR檢測』方法的驗證產(chǎn)品


下面列出的方法驗證所需產(chǎn)品，具體有四個表，供使用者參考：

表1.『支原體qPCR檢測』方法驗證所需產(chǎn)品


序號

品名

貨號

規(guī)格


1

支原體高敏標準品套裝

英文名：10CFU? Mycoplasma Sensitivity Standards-Mycoplasma set

（注：根據(jù)EP2.6.7，如果生產(chǎn)中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體Spiroplasma citri；如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關(guān)節(jié)液支原體M. synoviae）






102-0002

歐洲藥典2.6.7列舉的9種支原體每種有2管，10cfu/管，共18管；陰性對照2管


2

10CFUTM唾液支原體靈敏度標準品

英文名：10CFU? Mycoplasma Sensitivity Standards-Mycoplasma salivarium（可選）

（說明：日本藥典要求對10CFU唾液支原體的檢測進行驗證）





102-1103

10cfu×3管+陰性對照2管/盒


3

特異性驗證用標準品（詳見表2）




4

支原體DNA提取試劑盒

（適用于人工提取）

英文名：

Venor?GeM Sample Preparation Kit

56-1010

10次/盒



56-1050

50次/盒



56-1200

200次/盒


5

支原體熒光定量PCR檢測試劑盒

英文名：Verno? Gem qEP

11-9025

25次/盒



11-9100

100次/盒



11-9250

250次/盒


6

其他輔助產(chǎn)品（詳見表3）




7

qPCR方法驗證所需設(shè)備、儀器（詳見表4）




表2. 特異性驗證用標準品

根據(jù)EP2.6.7，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系，最適合用于特異性驗證。因此下表列出的是這3個菌屬的產(chǎn)品。用戶也可選擇自己生產(chǎn)過程中可能會遇到的細菌進行特異性驗證。更多特異性驗證用標準品請來電咨詢或訪問締一公司網(wǎng)站頁面：http://www.dyshengwu.com/cn/list_19.aspx?lcid=313


序號

品名

貨號

規(guī)格




1

丙酮丁酸梭菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts -Clostridium acetobutylicum

51-0792

≈10ng/管




2

產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts-Clostridium perfringens

2108-00756

≈10ng/管




3

嗜酸乳桿菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts-Lactobacillus acidophilus

51-1723

≈10ng/管




4

牛鏈球菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts-Streptococcus bovis

2122-20480

≈10ng/管




5

無乳鏈球菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts-Streptococcus dysgalactiae

2123-06176

≈10ng/管




6

變異鏈球菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts-Streptococcus mutans

2126-20523

≈10ng/管




7

肺炎鏈球菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts-Streptococcus pneumoniae

51-0566

≈10ng/管



8

血鏈球菌基因組DNA

英文名：Genomic DNA Extracts-Streptococcus sanguinis

2139-20068

≈10ng/管



表3.
其他輔助產(chǎn)品


序號

品名

貨號

規(guī)格







1

內(nèi)控對照（適合qPCR）

英文名：Internal Control DNA extra

（說明：Verno? Gem qEP試劑盒已提供有獨立包裝的內(nèi)控對照，用于監(jiān)測DNA提取和qPCR過程。如有更多需要，該對照也可單獨購買）

11-9905

4管/盒









2

蛋白酶K

英文名：Proteinase K

（說明：如果樣本的蛋白含量＞10mg/ml，會在支原體DNA抽提時堵塞離心柱，影響DNA抽提。建議先用德國MB公司的蛋白酶K消化，以保證支原體檢測的最高靈敏度。操作詳情請見德國MB公司的支原體DNA提取試劑盒說明書）

56-0002

50次/盒



表4. qPCR方法驗證所需設(shè)備、儀器


序號

設(shè)備


1

qPCR儀


2

移液器和帶濾芯吸頭（10、100和1000 μl）


3

超凈臺


4

小型離心機（適合1.5ml管）


5

恒溫儀（適合1.5ml或2ml反應(yīng)管，用于DNA提取時洗脫液的預(yù)熱）


6

自動核酸提取設(shè)備（可選）。也可手工提取。


希望以上信息能給您帶來幫助。

如您對以上產(chǎn)品感興趣，需要訂購或進一步咨詢詳情，請聯(lián)系德國MB中國區(qū)總代理：北京締一生物科技有限公司。