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支原體常規檢測方法匯總(二)

2021-11-23 16:15來源:威正翔禹|締一生物

大家晚上好!

上周我們一起討論了基于Venor?Gem qEP試劑盒的支原體qPCR經典檢測法,也是目前使用比較廣泛的方法之一。

當然啦,關于支原體的檢測,方法眾多。今天我們就來了解一下,操作相對更簡單的“一步法”。該方法會用到Minerva Biolabs公司的另一種試劑盒——VenorGeM? OneStep,它與上周介紹的經典法試劑盒類似,都是利用了熒光定量PCR的基本原理。


(前情提要在這里,戳戳下方圖片傳送到經典法支原體檢測試劑盒詳解)

不同的是,“一步法”試劑盒中,直接將內控添加到預混液中,使用起來更加方便、節省時間。

下面我們就來詳細介紹一下VenorGeM? OneStep支原體檢測試劑盒



使用方法




// 步驟


與經典法大致相同:


樣品處理?試劑制備?體系建立?啟動PCR反應?結果判定


樣品處理:


100μl左右的細胞上清液


95℃孵育后離心,取適量用于后續qPCR。



細胞培養樣品易含豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進行樣品穩定化處理。



試劑制備:


將緩沖液、預混液、陽性對照等試劑按照說明書要求,該離心的離心、該混合的混合,處理好后扣緊蓋子備用。


PCR體系建立:


在PCR管中,根據需要,加入樣品、陽性對照、新鮮培養基(陰性對照),并且設置好重復孔,蓋好蓋子,震蕩混勻。



啟動PCR反應:


按照所需參數,設置好PCR儀,啟動程序(具體參數詳見產品使用說明或是締一生物官方網站,點擊下方閱讀原文即可)。



FAM通道:檢測支原體熒光信號。

HEX通道:檢測內控對照熒光信號

支原體DNA和內控DNA,存在信號之間的競爭性抑制

支原體DNA越多,FAM通道信號越高

檢測內控對照的HEX信號通道信號越低。

定量需要基于Ct值和DNA標準曲線

Ct<40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。




小結:


總的來說,一步法試劑盒是經典版試劑盒的升級版。


在以下幾個方面都是相同的:


都具有高特異性:一次即可涵蓋所有常見易感染細胞的支原體物種(包括歐洲藥典規定的9種支原體)。與細菌和真核DNA無交叉反應。


都具有高靈敏度:最高檢測限可達到10CFU/ml。


③都具有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA,便于特異性驗證


④都有相應配套的支原體絕對定量標準品,便于最后定量檢測。


不同之處在于,一步法試劑盒省去了配置內控對照的環節,為實驗人員節省了寶貴時間,但相應的,價格也會比經典法試劑盒高出一部分。



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