支原體常規檢測方法匯總（四）

大家晚上好！

不知不覺

細胞培養過程中支原體檢測內容

已經更新到第四期了

回顧一下知識點

今天我們就來介紹最后兩種常見檢測法

ELISA法和PCR法

廢話不多說

我們直接上干貨

首先我們先來簡單了解一下ELISA：

支原體檢測過程中用到的ELISA，一般采用的是夾心法，針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體，來檢測培養物中是否含有支原體。

先用純化過的支原體抗體包被微孔板，制成固相抗體。

?

往微孔板中依次加入支原體（Mycoplasmal），再與 HRP（一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物）標記的支原體抗體結合，形成抗體 -抗原-酶標抗體復合物。

?

經過徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。

最后用酶標儀分析結果：

顏色的深淺和樣品中的支原體（ Mycoplasmal）呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度（ OD值），通過標準曲線計算樣品中支原體濃度。整個過程時間比較短，一般三四個小時就能出結果。

整個過程除取樣外，還包括標準品稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、結果分析，步驟比較多，且很多步驟都需要有一定經驗的人操作才能保證準確性，因此對技術要求比較高。

另外，由于依賴抗體的特性，該方法能夠檢測的支原體種類比較有限，對于沒有抗體的支原體，ELISA就無能為力了。

以Venor?Gem OneStep支原體常規PCR檢測試劑盒為例，簡單介紹一下實驗流程。

樣本處理

與qPCR類似

取適量待檢測樣品上清

95℃孵育10min

以對樣品進行穩定化處理

試劑制備

離心?按比例混合?靜置?混勻

PCR體系建立

設置好陰性對照、陽性對照、重復孔

扣緊蓋子混勻

啟動PCR反應

根據使用說明設置好程序

電泳結果分析

191bp為內控對照條帶，表明PCR反應正常。

當樣本存在支原體污染時，由于內控對照與支原體DNA存在競爭，內控對照條帶變弱（例如支原體DNA＞1000拷貝）。

陽性對照中支原體DNA＞10000拷貝，內控對照條帶會完全消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測結果。

如果待測樣本對PCR產生抑制，則內控對照條帶變弱（和陰性對照相比），此時應先進行DNA抽提（推薦使用：Venor? Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒），然后再檢測。

常規PCR的優點就是檢測時間短：2-3小時即可出結果、靈敏度高、特異性強、操作簡單。

缺點也很明顯，用PCR檢測已經進行過支原體滅活的樣品時，由于支原體DNA依然存在，所以此時PCR結果仍為陽性，說明該樣品曾經感染過支原體。

另外不同廠家的試劑盒差異比較大，需要謹慎選擇。

至此，幾種常規的檢測方法都已經介紹給大家啦，給大家做了個小總結，供參考。有些單一的檢測方法并不嚴謹，需要結合實驗情況，聯合使用多種方法進行檢驗，確保結果的可信度。

聲明：本網站所有注明“來源：締一生物”的內容，版權均屬于北京締一生物網站所有，受到知識產權的法律保護。如需引用、轉載，須注明來源及原文鏈接。如內容涉及實質性修改，須來電獲取書面授權，且轉載時，須注明“來源：締一生物”。

最終解釋權歸締一生物所有。