細胞培養(yǎng)的環(huán)境因素和營養(yǎng)條件有哪些?
環(huán)境因素
1.無菌環(huán)境
無毒和無菌是體外培養(yǎng)細胞的首要條件。細胞在活體內,解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)可抵抗微生物或其他有害物質的入侵,但細胞在體外培養(yǎng)的過程中,缺乏機體免疫系統(tǒng)的保護而喪失對微生物的防御能力和對有害物質的解毒能力。為保證細胞能在體外環(huán)境中生長繁殖,必須要確保無菌工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑和培養(yǎng)基以及無菌操作。
常見的微生物污染有支原體、細菌、真菌。支原體無致死毒性,可與細胞長期共存,對細胞有潛在影響,但體積小,不易鑒別,可借助于地衣紅或Hoechst33342染色來進行檢測。細菌增殖快,在短時間內即可大量擴增,并產(chǎn)生毒素殺死細胞。真菌的種類繁多,肉眼可見,漂浮于培養(yǎng)液面上,可呈絲狀、管狀或樹枝狀等。
2.合適的溫度
一般哺乳類與禽類細胞在體外培養(yǎng)的適宜溫度是37~38℃,不適宜的環(huán)境溫度會影響細胞的生長。細胞對低溫的耐受能力要強于對高溫的耐受能力,在低溫下,細胞的代謝活力及核分裂能力降低。若溫度不低于0℃,雖然細胞代謝受到影響,但無損傷作用;25~35℃時,細胞以緩慢的速度生長;但若被置于40℃數(shù)小時,則不僅不利于細胞生存、生長,甚至可導致其死亡。
3.適宜的滲透壓
高滲溶液或低滲溶液會引起細胞發(fā)生褶皺、腫脹、破裂。因此,滲透壓是體外培養(yǎng)細胞的重要條件之一。多數(shù)體外培養(yǎng)的細胞對滲透壓都有一定的耐受能力,實際應用中,260~320mmol/L的滲透壓可適用于大多數(shù)細胞。
4.氣體環(huán)境與pH
細胞的體外培養(yǎng)需要理想的氣體環(huán)境,氧氣、二氧化碳是細胞生存的必要條件。氧氣參與細胞的三羧酸循環(huán),為細胞生存、代謝與合成提供能量;二氧化碳既是細胞的代謝產(chǎn)物,是細胞生長的必需成分,又與維持培養(yǎng)液的pH有關。大多數(shù)細胞適宜的pH范圍往往是7.2~7.4。在開放式培養(yǎng)中,以5%的二氧化碳氣體比例為宜。
營養(yǎng)條件
1.培養(yǎng)基
細胞培養(yǎng)基包含細胞生長所需的各種營養(yǎng)物質,包括碳水化合物、氨基酸、無機鹽、維生素等。針對不同細胞的營養(yǎng)需求,有多種合成培養(yǎng)基可供選擇,如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。
2.其他添加成分
在各種合成培養(yǎng)基提供基礎營養(yǎng)物質之外,還需根據(jù)不同細胞和不同的培養(yǎng)目的添加其他成分,如血清、因子等。
血清提供的是細胞外基質、生長因子和轉鐵蛋白等重要物質,常用的是胎牛血清。要根據(jù)不同的細胞和不同的研究目的決定添加血清的比例。10%~20%的血清能維持細胞較快的生長增殖速度,稱為生長培養(yǎng)液;為維持細胞緩慢生長或不死,添加2%~5%的血清即可,稱為維持培養(yǎng)液。但血清中也存在有害于細胞生長和繁殖的物質,如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子;成分不明確,影響對結果的分析;不同動物、不同批次的血清活性差別較大,影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。
谷氨酰胺是細胞生長重要的氮源,在細胞生長代謝過程中起重要作用,但由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解,4℃下放置7天即可分解約50%,故谷氨酰胺需在使用前添加。
為防止污染,培養(yǎng)基中還需添加一定量的抗生素,常用抗生素名稱、濃度及敏感性如下表。
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