細胞有小黑點生長變慢，是細胞被支原體污染了嗎？

細胞培養實驗中，長得慢的細胞總會出現黑點，還有一些有漂浮的死細胞，崩解之后形成黑點和碎片，但還有一些是霉菌或支原體污染也會形成小黑點，小黑點對細胞狀態和實驗效果等都有影響，細胞有小黑點生長變慢，是細胞被支原體污染了嗎？

小黑點之所以這么令人頭痛，是由于它的數量會隨著培養時間的增加而不斷增加，當數量多到一定程度的時候，就會對細胞的生長造成一定的影響，嚴重影響科研的進展。在顯微鏡下觀察時往往表現為沒有光澤，體積較小的黑色顆粒。

一、細胞碎片

化學或物理的強烈刺激（例如胰酶消化時間過長，吹打細胞太過用力等）往往會導致細胞死亡，產生很多的細胞碎片。在顯微鏡下進行觀察時，可以看到很多呈不規則形態、沒有光澤的顆粒粘附在細胞培養皿的底部。

建議：狀態不好的細胞往往貼壁能力較強，因此切勿用移液器進行強力的吹打，從而損害了健康的細胞；另外，控制好胰酶消化的時間，只需要保證大部分正常的細胞被消化下來就可以了，然后更換新的細胞培養皿。

二、凋亡小體

體外培養的動物細胞很容易受到培養環境因素的影響，例如營養成分的改變、氧的供給、毒素、細胞代謝產物的積累、pH、 剪切力、細胞密度及微生物污染等。這些環境的改變都有可能誘發細胞的凋亡，從而產生很多分泌的凋亡小體。凋亡小體大多游離在培養基中，但也有一些會通過暴露的核酸彼此之間相互黏連，從而形成一個棕色的凋亡小體團塊，沒有細胞光澤。

建議：細胞培養的過程中一定要控制細胞傳代的時間，不能讓細胞“長過”；不要使用過酸或者過堿的培養基進行細胞培養；選用內毒素含量較低的血清。例如：選用Ausbian澳洲進口特級胎牛血清，內毒素含量≤3EU/ml，澳洲原裝進口胎牛血清。

三、血清中的沉淀

磷酸鈣是常見的一種沉淀物，通常會使血清出現渾濁，并且在37℃培養的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點，這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經常被誤認為是微生物污染。

建議：經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著增多，對于大多數的細胞而言是不需要進過高溫滅活處理的。例如：選用Ausbian澳洲進口特級胎牛血清，內毒素含量≤3EU/ml，澳洲原裝進口胎牛血清。

四、黑膠蟲

對于細胞培養過程中的小黑點到底是什么，目前呼聲最高的非黑膠蟲莫屬，但是小編查看了很多的資料，依舊不知道其為何方神圣。有人認為是從血清中來的一種原蟲，有人認為是細菌，或是真菌，也有人認為是血清中的蛋白結晶，因此消滅黑膠蟲的方式也是各式各樣。

建議：如果污染的細胞數量不是很多，建議直接丟棄，或者重新復蘇細胞進行培養。

五、支原體污染

一旦您在細胞培育的過程中發現有黑點生成，首先，要肉眼觀察培育基是否混濁，然后，在鏡下觀察培育細胞生長的狀態，黑點是否游動。假如細胞被污染，微生物則會大量繁衍，培育基就會迅速變黃、變混濁。污染包含細菌污染、支原體污染等。

建議：使用專業的細胞支原體去除劑Zell Shield，可去除細胞中支原體污染。   

細胞支原體去除試劑Zell Shield使用方法：

（1）在每次使用Zell Shield?之前，細胞傳代時，先使用廠家推薦的“懸浮沖洗法”處理好細胞，再使用加了Zell Shield?的培養基養細胞，能達到更好的祛除支原體的效果（“懸浮沖洗法”的詳細步驟，見下文）。

（2）Zell Shield?常規為-18℃保存，建議使用前，先融化分裝，仍舊-18℃避光保存，使用時按需融化配置。避免反復凍融。

（3）Zell Shield?按1:100濃度可直接加入培養基。例如：500ml培養基中添加5ml Zell Shield?，50mL/瓶的Zell Shield?可供5L培養基使用。

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