新研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇二磷酸PIP2調(diào)控pH調(diào)節(jié)蛋白AE2活性的機(jī)制

2024年1月26日，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究所尹玉新課題組在《NatureCommunications》在線發(fā)表題為“Structural and functional insights into the lipid regulation of human anion exchanger 2”的研究論文，報(bào)導(dǎo)了陰離子交換蛋白（AnionExchanger）AE2的跨膜區(qū)與PIP2的復(fù)合體結(jié)構(gòu)以及PIP2結(jié)合位點(diǎn)突變AE2的全長(zhǎng)高分辨冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并揭示了細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子PIP2對(duì)AE2活性調(diào)控的機(jī)制。

細(xì)胞內(nèi)pH受嚴(yán)格調(diào)控以維持在膜興奮性、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和囊泡運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。除氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)體外，SLC4和SLC26兩個(gè)家族是僅有的轉(zhuǎn)運(yùn)堿性離子HCO3-的轉(zhuǎn)運(yùn)體家族。SLC4家族共有10個(gè)成員，根據(jù)鈉離子依賴性和轉(zhuǎn)運(yùn)電化學(xué)特征可分為三類，其中AE1-3（SLC4A1-3）是不依賴Na+的陰離子（Cl–/HCO3–）交換轉(zhuǎn)運(yùn)體，而AE2組織分布最為廣泛，參與骨重吸收、胃酸分泌2和膽堿分泌3等生理活動(dòng)，AE2敲除小鼠模型出現(xiàn)骨硬化癥、無(wú)牙齒萌出、胃酸缺乏、雄性不育、膽管損傷等多種表型。AE2的功能異常也會(huì)導(dǎo)致人的骨硬化和原發(fā)性膽管炎的發(fā)生。AE2活性受環(huán)境pH、NH4+和滲透壓等因素調(diào)節(jié)，其跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和胞內(nèi)N端結(jié)構(gòu)域（NTD）分別參與感受不同因素的調(diào)控。

細(xì)胞膜蛋白處于被脂質(zhì)包圍的環(huán)境，其活性受脂質(zhì)調(diào)節(jié)的機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)，離子通道的相關(guān)研究遠(yuǎn)比轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的豐富。以往對(duì)SLC4家族的研究發(fā)現(xiàn)，PIP2能增強(qiáng)它NBCe1（SLC4A4）的功能。然而，2018年和2021年報(bào)導(dǎo)的SLC4家族成員NBCe1（SLC4A4）和NDCBE（SLC4A8）的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)并未觀察到PIP2的結(jié)合。2023年報(bào)導(dǎo)的AE1復(fù)合體的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)PIP2與AE1（SLC4A1）同源二聚體結(jié)合，但未進(jìn)一步研究PIP2對(duì)其功能的影響。尹玉新課題組2023年近期報(bào)導(dǎo)的SLC4家族成員BTR1（SLC4A11）的PIP2-復(fù)合體結(jié)構(gòu)顯示PIP2結(jié)合位點(diǎn)突變的BTR1構(gòu)象與酸性環(huán)境中BTR1構(gòu)象相似，提示了PIP2和pH對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控的相關(guān)性。而AE2作為不依賴Na+的陰離子（Cl–/HCO3–）交換轉(zhuǎn)運(yùn)體，其感受pH調(diào)控的機(jī)制以及PIP2是否參與調(diào)控AE2活性的調(diào)節(jié)尚不清楚。

研究人員通過(guò)解析AE2結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了結(jié)合在跨膜結(jié)構(gòu)域二聚體相互作用界面的PIP2分子。此狀態(tài)AE2無(wú)明顯的N端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域密度，跨膜結(jié)構(gòu)域處于inward-facing狀態(tài)。PIP2結(jié)合位點(diǎn)主要由TM7以及TM12和TM13之間的HL螺旋上氨基酸組成，與之前報(bào)導(dǎo)的AE1復(fù)合體結(jié)構(gòu)中PIP2位置一致。研究人員在AE2的PIP2結(jié)合位點(diǎn)引入突變并對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示TM7上的R932和HL上的K1147以及H1148突變導(dǎo)致AE2轉(zhuǎn)運(yùn)活性顯著減弱。藥物處理降低細(xì)胞膜上PIP2的水平同樣導(dǎo)致AE2的轉(zhuǎn)運(yùn)活性顯著減弱，表明PIP2對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體活性起激活作用。

隨后，通過(guò)解析PIP2結(jié)合位點(diǎn)突變的AE2（R932A/K1147A/H1148A），研究人員發(fā)現(xiàn)此狀態(tài)AE2的N端胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域存在明顯的相互作用，構(gòu)象與酸性環(huán)境中抑制狀態(tài)的AE2結(jié)構(gòu)相似。PIP2缺失引起TM7胞內(nèi)側(cè)部分發(fā)生明顯位移，TM10和TM11之間的β折疊與N端結(jié)構(gòu)域相互作用，協(xié)同將跨膜區(qū)構(gòu)象穩(wěn)定在inward-facing狀態(tài)。

綜上所述，研究者們通過(guò)解析不同狀態(tài)的AE2冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了AE2的激活因子PIP2，并且從原子水平觀察到了PIP2如何調(diào)控AE2跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的構(gòu)象變化，為進(jìn)一步研究AE2的調(diào)控機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

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