研究證明12種動物卵細胞中非編碼小RNA的表達和潛在功能

3月26日，國際學術期刊Genome Biology在線發表了中國科學院分子細胞科學**創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）吳立剛研究組的最新研究成果“Divergent composition and transposon-silencing activity of small RNAs in mammalian oocytes”。該研究證明了哺乳動物卵細胞中非編碼小RNA組成和功能的多樣性，為今后研究非編碼小RNA參與哺乳動物卵細胞發育的功能和機制提供了重要基礎。

非編碼小RNA廣泛參與基因的表達調控，在生殖細胞中，主要存在3類非編碼小RNA：microRNA （miRNA）、endogenous small interfering RNA （endo-siRNA）和PIWI-interacting RNA （piRNA）。其中miRNA和endo-siRNA的長度主要集中在22 nt，與Argonaute （AGO）蛋白結合形成RNA介導的轉錄沉默復合體（RISC），piRNA則與PIWI蛋白結合形成復合體。已有研究表明miRNA、endo-siRNA和piRNA在不同物種的卵細胞發育中行使的功能存在顯著差別。例如，在果蠅卵細胞發育中，miRNA和piRNA的存在均是必須的；在斑馬魚卵細胞發育中，只有piRNA是必不可少的；而在小鼠卵細胞發育中，僅有endo-siRNA的存在是必須的。以上發現說明，在動物卵細胞發育中，非編碼小RNA的組成和功能可能存在極大的多樣性。

目前絕大多數關于哺乳動物生殖細胞非編碼小RNA組成和功能的研究在小鼠中進行，小鼠中得到的一些結論也通常會推及至其他物種。但吳立剛研究組的早期研究表明，在人類卵細胞中表達一種新型、結合PIWIL3且末端無修飾的短piRNA，與經典結合PIWIL1的長piRNA不同（2019,Nature communications）。隨后，吳立剛研究組與南京醫科大學李建民課題組合作揭示了在金黃倉鼠這一物種中，piRNA通路不僅調控精子的發育，對卵細胞的正常發育以及雌性生殖也是必需的（2021,Nature Cell Biology；2023,Nature communications）。以上研究表明，不同哺乳動物卵細胞內非編碼小RNA的組成和功能同樣也具有多樣性。

為了全面分析和系統比較不同哺乳動物卵細胞中非編碼小RNA的組成、特征和潛在功能，研究人員對12個物種包括人、食蟹猴、小鼠、大鼠、金黃倉鼠、中國倉鼠、兔子、豚鼠、比格犬、豬、羊和斑馬魚的卵細胞進行mRNA和非編碼小RNA深度測序和分析。研究人員根據非編碼小RNA在基因組的分布和序列特征，在12個物種中均鑒定到了piRNA，除了小鼠，其余11個物種中的piRNA豐度遠高于其他類型的小RNA。該結果表明哺乳動物卵細胞中的piRNA豐度普遍較高，長度分布具有物種特異性。并且，研究人員發現Endo-siRNA僅在小鼠卵細胞中表達，而在其他10種哺乳動物的卵細胞中，都沒有檢測到endo-siRNA，因此可以推測大部分哺乳動物（包括與小鼠親緣關系很近的大鼠）的卵細胞可能并不表達endo-siRNA，小鼠只是一個特例，并不適合作為模型來研究非編碼小RNA在雌性生殖調控中的功能。因此，研究人員認為，未來關于雌性生殖的研究中，在選擇動物模型時，非編碼小RNA組成的相似性應該被列為重要的考慮因素之一。

研究人員進一步對哺乳動物的卵細胞進行了PIWI蛋白免疫沉淀實驗和微量小RNA高碘酸鈉氧化實驗，發現PIWIL3結合的os-piRNA在哺乳動物卵細胞中廣泛存在，其3’末端不帶有2’甲氧基修飾。通過分析物種間piRNA序列和piRNA cluster的保守性，發現物種間piRNA cluster的序列保守性遠低于其兩側編碼基因和基因間區序列，并且piRNA的序列一致性在不同物種中也非常低。研究人員進一步分析了在piRNA cluster中分布的轉座子組成，發現其在物種間的差異很大。通過對轉座子的序列變異度進行分析，結果表明低變異度的轉座子通常對應更高豐度的piRNA，而低變異度的轉座子通常是潛在的活躍的轉座子。因此，研究人員推測為了抵御活躍轉座子的威脅，piRNA的序列和豐度在不同物種間發生了快速進化。

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