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細胞培養時如何進行支原體污染的檢測

2024-06-13 16:09

在細胞培養過程中,支原體污染的檢測至關重要,以確保實驗結果的準確性和可靠性。以下是支原體污染檢測的主要方法和步驟:

1.相差顯微鏡檢測

原理:支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。

步驟:

將細胞接種于事先放置于培養瓶內的蓋玻片上。

24小時后取出,用相差油鏡觀察。

2.熒光染色法

原理:利用熒光染料使支原體DNA著色,通過熒光顯微鏡觀察。

熒光染劑Hoechst 33258檢測支原體污染的原理:染色劑會結合到DNA A-T富含區域,支原體A-T含量較高(55~80%),因此可將其染色而檢測。

步驟:

制備標本:在六孔板中制備蓋玻片細胞培養物,接種待測細胞,培養12天。

固定:用新鮮配制的13冰醋酸/甲醇固定液固定15分鐘,重復固定一次,然后干燥。

染色:用Hoechst 33258熒光染液染色30分鐘,避光操作。

洗滌:用雙蒸水浸泡染色過的蓋玻片3次,每次35分鐘。

封片:滴加含50%甘油的檸檬酸緩沖液到染色過的細胞表面,然后封片。

觀察:在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光分布狀態,判斷有無支原體污染及污染程度。

3.PCR法檢測支原體

原理:基于酶促DNA合成反應,擴增支原體DNA,檢測其存在。

步驟:

提取標本DNA(如酚氯仿法)。

使用特定引物和DNA聚合酶進行PCR擴增。

通過凝膠電泳或其他方法檢測PCR產物,確認支原體污染。

4.掃描電子顯微鏡法

原理:利用掃描電子顯微鏡直接觀察支原體。

特點:直觀、準確,但操作復雜,實驗周期長,常作為最后定性檢測。

5.DNA分子雜交檢測或支原體培養等方法

這些方法也可以用于檢測支原體污染,但具體步驟和原理因方法而異。

注意事項

在進行支原體污染檢測時,應使用無菌技術和適當的防護措施,以避免交叉污染。

選擇合適的檢測方法和步驟,根據實驗需求和條件進行選擇。

對于疑似支原體污染的細胞培養物,應及時采取措施進行處理,以避免對實驗結果產生不良影響。