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以TaqMan探針為例熒光定量pcr技術(shù)基本原理

2024-07-02 16:41

TaqMan熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）是一種高度特異性和靈敏度的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測、突變分析等領(lǐng)域。其基本原理在于利用Taq DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性，在PCR擴(kuò)增過程中切斷特異性探針，從而釋放熒光信號，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)核酸序列的定量檢測。

一、技術(shù)原理

1. 探針設(shè)計(jì)

TaqMan熒光定量PCR的核心在于特異性探針的設(shè)計(jì)。探針通常是一條單鏈寡核苷酸，其5’端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)（R），3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Q）。探針的結(jié)合位點(diǎn)在兩條PCR引物之間，確保其在PCR擴(kuò)增過程中與模板DNA特異性結(jié)合。

2. PCR擴(kuò)增過程

在PCR反應(yīng)體系中，除了常規(guī)的引物、dNTPs、反應(yīng)緩沖液和Taq DNA聚合酶外，還需加入TaqMan探針。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，Taq DNA聚合酶在模板鏈上從5’到3’方向合成新的DNA鏈。當(dāng)Taq酶遇到與模板結(jié)合的探針時(shí)，其5’→3’外切核酸酶活性會切斷探針，導(dǎo)致報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離。

3. 熒光信號的產(chǎn)生

在探針完整時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到熒光信號。然而，當(dāng)探針被切斷后，報(bào)告熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不再被吸收，從而發(fā)出熒光信號。因此，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號就會同步增長，其強(qiáng)度代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 設(shè)計(jì)引物和探針

根據(jù)目標(biāo)基因序列，設(shè)計(jì)合適的PCR引物和TaqMan探針。引物的GC含量建議在40-60%，Tm值在55-60℃，而探針的長度通常在25-35bp，Tm值在65-70℃，以確保探針與模板結(jié)合的特異性。

2. 準(zhǔn)備模板

提取待測樣本的DNA或RNA，并將其作為模板用于PCR反應(yīng)。對于RNA樣本，通常需要先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA。

3. 反應(yīng)體系準(zhǔn)備

根據(jù)試劑盒說明書，準(zhǔn)備反應(yīng)體系，包括反應(yīng)緩沖液、引物、探針、dNTPs和Taq DNA聚合酶等。TaqMan qPCR Master Mix（2x，無Rox）是一種常用的試劑，它包含了熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、dNTPs和反應(yīng)緩沖液等關(guān)鍵成分，使得實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作更加便捷。

4. 設(shè)定反應(yīng)條件

根據(jù)引物和探針的特性，設(shè)置合適的PCR反應(yīng)條件，包括溫度和時(shí)間等。

5. 加樣和運(yùn)行PCR

將準(zhǔn)備好的反應(yīng)體系和模板加入PCR儀中，開始運(yùn)行PCR反應(yīng)。在PCR反應(yīng)過程中，儀器會實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號，并記錄每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度。

6. 數(shù)據(jù)采集和分析

根據(jù)熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)的關(guān)系，繪制熒光定量曲線，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出目標(biāo)基因的初始拷貝數(shù)或相對表達(dá)量。

三、優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)

特異性好：基于引物和探針的雙重特異性，能夠準(zhǔn)確檢測目標(biāo)核酸序列。

高靈敏度：在低拷貝數(shù)的模板DNA下也能獲得可靠的熒光信號。

兼容多重檢測體系：可以根據(jù)不同的序列合成不同的特異性探針，實(shí)現(xiàn)多重檢測。

缺點(diǎn)

探針合成費(fèi)用高：探針的設(shè)計(jì)和合成成本較高，增加了實(shí)驗(yàn)成本。

設(shè)計(jì)難度大：需要精確設(shè)計(jì)引物和探針，確保其特異性和穩(wěn)定性。

四、應(yīng)用前景

TaqMan熒光定量PCR技術(shù)因其高特異性和靈敏度，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品安全等多個(gè)領(lǐng)域。在疾病的早期診斷、藥物研究、病原微生物檢測和轉(zhuǎn)基因食品檢測等方面，該技術(shù)發(fā)揮著重要作用。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，TaqMan熒光定量PCR將在更多領(lǐng)域展現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)勢和應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，TaqMan熒光定量PCR技術(shù)以其獨(dú)特的原理和優(yōu)勢，在分子生物學(xué)研究中占據(jù)重要地位。通過不斷優(yōu)化和完善實(shí)驗(yàn)條件，該技術(shù)將為科學(xué)研究的深入和生命科學(xué)的發(fā)展做出更大貢獻(xiàn)。