支原體污染pcr檢測(cè)步驟

支原體污染PCR檢測(cè)步驟主要包括樣品收集與處理、DNA提取、PCR反應(yīng)體系配置、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳以及結(jié)果分析等幾個(gè)關(guān)鍵步驟。以下是詳細(xì)的步驟說明：

一、樣品收集與處理

樣品收集：

收集待測(cè)細(xì)胞系的培養(yǎng)上清液，通常是在細(xì)胞培養(yǎng)后的一段時(shí)間（如3-7天）進(jìn)行收集。

確保在收集樣品前數(shù)天或至少在解凍后兩周內(nèi)，沒有加入任何抗生素，以保證支原體在培養(yǎng)上清中的效價(jià)在PCR測(cè)定范圍之內(nèi)。

樣品處理：

將收集到的培養(yǎng)上清液進(jìn)行離心處理，以去除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。

使用適當(dāng)?shù)木彌_液（如D-PBSA）重懸沉淀，并進(jìn)行多次洗滌，以進(jìn)一步純化樣品。

二、DNA提取

加熱處理：

將處理后的樣品加熱至一定溫度（如90°C）并保持一段時(shí)間（如15分鐘），以裂解細(xì)胞并釋放DNA。

DNA抽提：

采用標(biāo)準(zhǔn)的DNA抽提方法（如酚/氯仿抽提法、乙醇沉淀法等）從樣品中提取DNA。

注意避免交叉污染，確保DNA的純度。

三、PCR反應(yīng)體系配置

準(zhǔn)備反應(yīng)液：

根據(jù)PCR試劑盒的說明或?qū)嶒?yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)流程，配置PCR反應(yīng)液。

通常包括引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、緩沖液等必要成分。

加入模板DNA：

將提取的DNA作為模板加入到PCR反應(yīng)液中。

注意控制DNA的加入量，避免過多或過少。

四、PCR擴(kuò)增

設(shè)置PCR程序：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置合適的PCR擴(kuò)增程序，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟。

通常包括一個(gè)初始的預(yù)變性步驟（如95°C，7分鐘），隨后是多個(gè)循環(huán)的變性（如95°C，4秒）、退火（如65°C，8秒）和延伸（如72°C，16秒）步驟，每個(gè)循環(huán)的延伸時(shí)間可以逐漸增加。

進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

將配置好的PCR反應(yīng)液放入PCR儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。

注意監(jiān)控PCR儀的運(yùn)行狀態(tài)，確保擴(kuò)增過程順利進(jìn)行。

五、瓊脂糖凝膠電泳

制備瓊脂糖凝膠：

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要制備適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠（如2%），并加入適量的電泳緩沖液。

點(diǎn)樣與電泳：

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與適量的加樣緩沖液混合后，點(diǎn)樣到瓊脂糖凝膠的孔中。

在電泳儀上進(jìn)行電泳，通常使用恒壓或恒流模式進(jìn)行電泳。

六、結(jié)果分析

觀察電泳結(jié)果：

在紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠上的電泳條帶。

注意比較樣品條帶與陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照條帶的位置和亮度。

判斷結(jié)果：

如果樣品條帶出現(xiàn)在陽(yáng)性對(duì)照條帶相同的位置，且亮度相近或稍弱，則可判斷為支原體污染陽(yáng)性。

如果樣品條帶未出現(xiàn)或位置與陽(yáng)性對(duì)照條帶明顯不同，則可判斷為支原體污染陰性或假陰性。

需要注意的是，PCR檢測(cè)支原體污染具有高度的靈敏性和特異性，但也可能受到實(shí)驗(yàn)條件、操作技術(shù)等多種因素的影響。因此，在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。