qPCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如何避免核酸污染

在定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）實(shí)驗(yàn)中，核酸污染是一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題，它不僅影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可能帶來(lái)嚴(yán)重的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。因此，避免核酸污染是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。以下是一系列預(yù)防和處理核酸污染的措施。

1. 實(shí)驗(yàn)室的合理布局與分區(qū)

合理的實(shí)驗(yàn)室布局是預(yù)防核酸污染的基礎(chǔ)。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的qPCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。每個(gè)區(qū)域應(yīng)獨(dú)立通風(fēng)，通過(guò)壓力系統(tǒng)控制空氣流動(dòng)方向，形成單**向，即從試劑準(zhǔn)備區(qū)流向產(chǎn)物分析區(qū)。這種布局可以大大減少不同區(qū)域間的交叉污染。

2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備的專用與清潔

各區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，并明確標(biāo)記，避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等在不同區(qū)域間混淆使用。此外，實(shí)驗(yàn)設(shè)備應(yīng)定期清潔和消毒，特別是移液器、離心機(jī)等頻繁使用的設(shè)備。移液器污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題，操作時(shí)應(yīng)小心，避免將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭。使用德國(guó)MB公司的PCR Clean清潔實(shí)驗(yàn)環(huán)境

3. 實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范與防護(hù)

實(shí)驗(yàn)人員需要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)。在標(biāo)本處理、試劑配制、核酸擴(kuò)增等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，應(yīng)采用生物安全柜等專用設(shè)備，以有效捕獲和過(guò)濾實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的氣溶膠。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、儀器設(shè)備等進(jìn)行徹底清潔和消毒，防止殘留污染。

4. 試劑與耗材的管理

所有PCR試劑都應(yīng)小量分裝，以減少重復(fù)加樣次數(shù)和污染機(jī)會(huì)。PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。使用一次性耗材，如吸頭、離心管等，可以避免交叉污染。

5. 設(shè)立適當(dāng)?shù)膶?duì)照

設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可靠性和判斷擴(kuò)增系統(tǒng)可信性的重要手段。陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性。陰性對(duì)照則用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否存在污染。

6. 實(shí)驗(yàn)室的清潔與消毒

定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全面消毒，包括使用紫外線照射、化學(xué)消毒劑噴灑等方法。使用專業(yè)的核酸污染清除劑對(duì)實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、設(shè)備、地面等進(jìn)行徹底清潔和消毒。清理污染物時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵循活病毒生物安全操作要求，采用壓力蒸汽滅菌處理，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室換氣等，防止次生危害。

7. 實(shí)驗(yàn)后的處理與監(jiān)測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有的試劑應(yīng)按照要求進(jìn)行存放，廢料和廢液及時(shí)清理，避免存放過(guò)多和過(guò)久。使用有效氯含量的消毒水對(duì)移液槍、離心管架等物品進(jìn)行浸泡消毒。對(duì)污染區(qū)域內(nèi)的設(shè)備，如擴(kuò)增儀、全自動(dòng)提取儀等，使用核酸氣溶膠污染清除劑進(jìn)行反復(fù)處理。同時(shí)，設(shè)計(jì)陰性對(duì)照組，根據(jù)陰性對(duì)照確認(rèn)污染情況，確保污染得到控制后再恢復(fù)正常實(shí)驗(yàn)。

避免核酸污染需要從實(shí)驗(yàn)室布局、設(shè)備管理、實(shí)驗(yàn)操作、試劑與耗材管理、對(duì)照設(shè)立、清潔與消毒以及實(shí)驗(yàn)后處理等多個(gè)方面入手。只有嚴(yán)格遵守這些措施，才能確保qPCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。