一種基于結(jié)核分枝桿菌特異性鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白IrtAB的新型熒光探針

　　近期，清華大學藥學院劉剛教授課題組在ACS Central Science發(fā)表了題為“Insights into IrtAB: Iron Transport Facilitates Ultrasensitive Detection of Mycobacteria in Both Cellular and Clinical Environments”的研究論文( https://doi.org/10.1021/acscentsci.4c00676.)。

　　本研究報道了一種基于結(jié)核分枝桿菌特異性鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白IrtAB的新型熒光探針，該探針具備鐵離子響應開關功能，實現(xiàn)了迄今為止在細胞水平和臨床菌學水平上對結(jié)核分枝桿菌最靈敏、超快速的檢測。

　　研究背景

　　結(jié)核病 (Tuberculosis，TB)是由單一病原體結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的傳染病。結(jié)核病最常見的是肺結(jié)核 (pulmonary TB)，會導致肺組織破壞，出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血等癥狀，嚴重者可發(fā)展為呼吸衰竭。若未及時治療，結(jié)核菌可傳播至其他器官，導致結(jié)核性腦膜炎、骨結(jié)核、腎結(jié)核等。WHO研究報告顯示，2023年全球約有1080萬的新發(fā)結(jié)核病例和125萬的死亡病例[1]。自新冠之后 (COVID-19，2020 to 2021)，TB再次成為致死人數(shù)最多的單一病原體感染引起的疾病[2]。

　　菌學診斷是結(jié)核病確診的金標準，其中用于染色結(jié)核分枝桿菌細胞壁成分的金胺O法，已沿用超過百年。自2014年WHO在全球推廣Xpert MTB/RIF技術以來，結(jié)核病的診斷和年度新發(fā)病例的減少效率并未顯著提升，可能的原因包括：一是該技術檢測成本昂貴，在TB高負擔國家和地區(qū)普及困難，二是，高達約三分之一的新確診結(jié)核病患者已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性，該法并不能給出藥敏結(jié)果，用于精準指導用藥。因此，快速、高靈敏度的細菌學檢測方法仍然是研究的重點。單細胞熒光診斷技術因其高靈敏度、高特異性、快速檢測及較低成本等優(yōu)勢，備受期待。目前雖然報道了一些基于代謝途徑和酶開關機制的Mtb熒光探針，但其靈敏度較低 (>100 μM)，響應時間長(>1 h)，且停留在實驗室水平，尚無臨床轉(zhuǎn)化的成果。

　　劉剛教授課題組長期致力于新型結(jié)核熒光探針的研究，先前報道了多個基于特異性硝基還原酶開關機制的新型Mtb熒光探針(Analytic Chemistry, 2024, 96, 4, 1576-1586;Chem Commun (Camb). 2021, 57, 13174-13177.)及藥敏實驗方法(ACS Infect. Dis. 2019, 5(6), 949-961)，同時實現(xiàn)了良好的標記宿主細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌能力。這些熒光團包括香豆素探針、花菁熒光探針及羅丹明熒光探針。

　　本研究則聚焦于結(jié)核分枝桿菌細胞膜上的鐵載體轉(zhuǎn)運蛋白IrtAB，利用其主動從外環(huán)境攝取并轉(zhuǎn)運極微量鐵離子的機制，開發(fā)出一種超靈敏且快速的新型熒光試劑

　　研究內(nèi)容

　　研究首先對結(jié)核分枝桿菌自身分泌的鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白IrtAB天然配體mycobactin (MbT)進行了結(jié)構(gòu)修飾，并在分子骨架上分別引入S構(gòu)型、R構(gòu)型甲基，合成了不同的MbT類似物(圖1)，實現(xiàn)了該類多肽化合物的克級制備能力。研究系統(tǒng)考察了紅色熒光團，包括花菁系列熒光團 (Cy)和羅丹明系列熒光團 (Rho)，設計并合成了系列MbT-熒光團共綴探針 (MbTCFps，圖2)。

　　圖2 MbTCFps的化學結(jié)構(gòu)

　　研究發(fā)現(xiàn)新型探針分子N14G相較于其它熒光分子，表現(xiàn)出最強的菌內(nèi)熒光強度，且具有極高的靈敏度，在濃度低至1.0 nM條件下，依舊可以對M. smegmatis菌實現(xiàn)19倍的熒光增強作用;在10 nM條件下，只需5分鐘的孵育時間，即可實現(xiàn)134倍的熒光增強作用。共聚焦熒光顯微鏡成像顯示，N14G對M. smegmatis標記主要集中在細胞膜上，與IrtAB轉(zhuǎn)運蛋白在結(jié)核菌細胞膜上高表達密切相關。延長孵育時間至24小時，N14G依舊具有良好的熒光標記能力，證明N14G在孵育過程中具有優(yōu)異的化學穩(wěn)定性和光學穩(wěn)定性。熱致死和抗TB藥物處理實驗結(jié)果顯示，細菌在死亡/損傷條件下，對N14G的攝取顯著降低，再次驗證了MbT轉(zhuǎn)運和細胞結(jié)構(gòu)/膜結(jié)構(gòu)的完整性密切相關。　　

　　分子對接顯示，N14G和N14G-Fe和IrtAB蛋白的結(jié)合部分(SID)均有較強的相互作用。采用IrtAB的敲除菌和回補菌再一次研究證明，熒光的產(chǎn)生依賴于IrtAB轉(zhuǎn)運蛋白(圖5)。　

　　與北京胸科醫(yī)院孫照剛教授合作研究證明，N14G和N14G-Fe對結(jié)核分枝桿菌野生株H37Rv的檢測限為34個菌落。對于臨床TB患者痰液的診斷，N14G和N14G-Fe也只需0.1 μM的濃度及10 分鐘染色時間就能有效標記TB患者痰液中的結(jié)核菌，其靈敏度遠超現(xiàn)有標準診斷試劑金胺O(圖6)。

　　總結(jié)

　　本研究以結(jié)核菌的膜轉(zhuǎn)運蛋白(IrtAB)為靶點，基于鐵載體的轉(zhuǎn)運機制和三價鐵離子控制的熒光開關機制，開發(fā)了新型結(jié)核菌熒光探針。這種熒光探針具有超高靈敏度(1-10 nm)和超快響應速度(5-10分鐘)的特點，可用于快速檢測結(jié)核分枝桿菌，尤其在臨床上可實現(xiàn)對結(jié)核病患者痰液的快速診斷。

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