生物制品中支原體檢測(cè)的方法

生物制品中支原體檢測(cè)的方法主要包括以下幾種：

一、培養(yǎng)法

原理：從樣品細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，接種到適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上生長(zhǎng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。

優(yōu)點(diǎn)：操作規(guī)范的情況下，很少會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)精確度很高，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，也是《美國(guó)藥典》中認(rèn)可的支原體檢測(cè)方法之一。

缺點(diǎn)：

檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。

無(wú)法對(duì)曾經(jīng)感染過(guò)的樣品做出判斷。

能鑒定的支原體種類有限，例如支原體M. Hyorhinis等無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)。

二、指示細(xì)胞法（DNA染色法）

原理：將供試品接種于無(wú)污染、標(biāo)準(zhǔn)化的指示細(xì)胞（如Vero細(xì)胞或經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞）中培養(yǎng)，然后用特異熒光染料進(jìn)行染色。支原體中的核酸可以被著色，如果待檢測(cè)細(xì)胞中含有支原體，就會(huì)導(dǎo)致指示細(xì)胞被感染，進(jìn)而在細(xì)胞膜或培養(yǎng)基等處發(fā)現(xiàn)藍(lán)色熒光。

優(yōu)點(diǎn)：

可用于檢測(cè)一些不易培養(yǎng)的支原體，如豬鼻支原體。

耗時(shí)較短，同時(shí)可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

缺點(diǎn)：

存在假陽(yáng)性和假陰性的可能。例如，一些死亡細(xì)胞釋放出來(lái)的DNA會(huì)被染成藍(lán)色，導(dǎo)致假陽(yáng)性；或由于熒光過(guò)弱而出現(xiàn)假陰性，使結(jié)果出現(xiàn)偏差。

口腔支原體和精氨酸支原體對(duì)細(xì)胞或蓋玻片吸附能力較差，容易出現(xiàn)檢測(cè)時(shí)的假陰性。

三、核酸法

原理：通過(guò)對(duì)樣品中可能存在的支原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，來(lái)判斷樣品是否被支原體污染。常用的核酸法主要有常規(guī)PCR法和熒光定量PCR法（qPCR）。

優(yōu)點(diǎn)：

快速、敏感、方便，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物制品生產(chǎn)中所需的大部分原輔材料和半成品的支原體檢驗(yàn)。

qPCR法還具有較高的特異性和靈敏度，且易于自動(dòng)化操作。

缺點(diǎn)：

qPCR法檢測(cè)支原體的能力依賴于擴(kuò)增引物序列的廣泛性和特異性，不同的核酸提取方法、擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序可能會(huì)對(duì)陽(yáng)性樣本的檢出效率產(chǎn)生影響。

qPCR法檢出的是支原體的基因組，無(wú)法鑒別樣品中的支原體是否存活或是否為支原體相近種屬的微生物污染。因此，需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

四、ELISA法

原理：基于抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)檢測(cè)樣品中支原體特異性抗體或抗原的存在來(lái)判斷支原體感染情況。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、特異性和敏感性均比較強(qiáng)。

缺點(diǎn)：對(duì)檢測(cè)環(huán)境和儀器的要求較高，容易發(fā)生交叉感染。

五、其他方法

除了上述方法外，還有一些其他方法如高通量測(cè)序（NGS）法、激光力細(xì)胞學(xué)（LFC）法等，這些方法在靈敏度、簡(jiǎn)便性和快捷性方面可能具有優(yōu)勢(shì)，但需要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后才能考慮作為支原體檢測(cè)的補(bǔ)充方法。

總的來(lái)說(shuō)，在選擇支原體檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)際的應(yīng)用場(chǎng)景、檢測(cè)需求以及成本等因素進(jìn)行綜合考慮。同時(shí)，為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，還應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和驗(yàn)證。