CCA顯色培養(yǎng)基在水的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

國(guó)際知名微生物檢測(cè)產(chǎn)品生產(chǎn)商HiMedia Laborotaries公司生產(chǎn)的CCA顯色培養(yǎng)基（貨號(hào)：M1991I-500G，英文品名：HiCromeTM Chromogenic Coliform Agar）是一款值得注意的產(chǎn)品，因?yàn)樗某煞趾托阅芊献钚掳娴腎SO9308-1標(biāo)準(zhǔn)（2014版），而該標(biāo)準(zhǔn)論述的正是有關(guān)大腸桿菌和大腸菌群計(jì)數(shù)的水質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)。

ISO9308-1.2014采用的是濾膜法聯(lián)合CCA顯色培養(yǎng)基法，用于水中大腸桿菌和大腸菌群的計(jì)數(shù)。它出結(jié)果的時(shí)間更短，只有24小時(shí)（而2000年版ISO9308采用乳糖TTC瓊脂，需48小時(shí)），而且無(wú)須額外的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

在CCA顯色培養(yǎng)基中，大腸菌群（不含大腸桿菌）表達(dá)β-D-半乳糖苷酶，分解顯色底物，從而為粉紅色菌落；大腸桿菌同時(shí)表達(dá)β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶，表現(xiàn)為藍(lán)紫色菌落；而其他非大腸菌群菌（如綠膿桿菌、沙門氏菌）為無(wú)色；糞腸球菌的生長(zhǎng)則受到抑制。

圖. HiCromeTM CCA顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)反應(yīng)

為什么要同時(shí)檢測(cè)大腸菌群和大腸桿菌？對(duì)于人類來(lái)說(shuō)，水被糞便污染一直是一個(gè)問(wèn)題。大腸桿菌，其實(shí)是人腸道的正常菌群，它隨糞便被排出體外，因而被看作是水是否被糞便污染的指示菌。大腸菌群則較為復(fù)雜，因?yàn)橛械拇竽c菌群生活在土壤和新鮮的地表水中，并不總是在人的腸道內(nèi)。大腸菌群并不作為糞便污染的指征，但可以指示出水在凈化、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中存在的問(wèn)題。

ISO9308-1.2014中的操作方法大致如下：先取水樣100ml（或其他體積），在5±3℃運(yùn)輸和保存。應(yīng)保證在取樣的24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。再將水樣用濾膜過(guò)濾。過(guò)濾膜應(yīng)47mm或50mm直徑，0.45μm孔徑，**有網(wǎng)格線，并且需保證無(wú)菌。過(guò)濾后細(xì)菌就被截留在濾膜上，然后將濾膜貼到CCA顯色培養(yǎng)基上。放置時(shí)應(yīng)保證下面沒(méi)有氣泡。然后倒轉(zhuǎn)平板，孵育21±3小時(shí)，36±2℃。之后就可檢查過(guò)濾膜上的菌落并計(jì)數(shù)。

ISO9308-1.2014指出，顯色后，大腸菌群（粉紅色菌落）應(yīng)再用氧化酶試紙條進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（大腸菌群為氧化酶陰性），因?yàn)橐恍┭趸戈?yáng)性菌(如氣單胞菌屬)可能帶來(lái)假陽(yáng)性。具體是應(yīng)至少選擇10個(gè)粉紅菌落，進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或向平皿中的濾膜滴加氧化酶試劑2-3滴，陽(yáng)性反應(yīng)為深藍(lán)色（30秒內(nèi)）。大腸桿菌無(wú)須驗(yàn)證。如需驗(yàn)證時(shí)，可進(jìn)行吲哚試驗(yàn)。大腸桿菌為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，而其他大腸菌群為陰性。

值得指出的是，該標(biāo)準(zhǔn)方法選擇性不強(qiáng)，它適合低菌群背景的樣本，因?yàn)楸尘吧L(zhǎng)可能干擾計(jì)數(shù)。ISO指出，它最適合菌落數(shù)小于100的水樣，例如：飲用水、自來(lái)水、消毒的池水，而對(duì)于地表水和井水，該方法并不適合。

注意：對(duì)于大腸桿菌O157，CCA培養(yǎng)基不會(huì)將其識(shí)別為大腸桿菌。大腸桿菌O157將被識(shí)別為大腸菌群。對(duì)于總大腸菌群計(jì)數(shù)，它應(yīng)等于氧化酶陰性的粉紅色菌落數(shù)+藍(lán)紫色菌落數(shù)。

據(jù)ISO資料顯示：CCA培養(yǎng)基的靈敏度為94%（大腸桿菌）和91%（大腸菌群），特異性為97%（大腸桿菌）和94%（大腸菌群），可見(jiàn)性能還是相當(dāng)不錯(cuò)的。而HiMedia公司更提供有化學(xué)限定的CCA顯色培養(yǎng)基，這保證培養(yǎng)基的批間差異極小，批次結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性和準(zhǔn)確度進(jìn)一步提升。

我國(guó)《GB8538—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)·飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》提到濾膜法計(jì)數(shù)大腸菌群。具體是將過(guò)濾水樣的濾膜貼在選擇性鑒別培養(yǎng)基上，經(jīng) 37℃ 培養(yǎng)24h后，大腸菌群細(xì)菌在濾膜上長(zhǎng)出具有特征性的菌落，直接計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)，計(jì)算出每 100mL 水樣中所含的大腸菌群數(shù)。所用培養(yǎng)基為遠(yuǎn)藤瓊脂(品紅亞硫酸鈉)培養(yǎng)基。長(zhǎng)出的菌落還需進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。如為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，經(jīng)36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h 后，如產(chǎn)酸產(chǎn)氣則判定為大腸菌群陽(yáng)性。整體耗時(shí)較長(zhǎng)，步驟較多。

《GBT5750.12-2006 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法——微生物指標(biāo)》檢測(cè)指標(biāo)包括總大腸菌群和大腸埃希氏菌，都提到酶底物法。總大腸菌群也是根據(jù)用選擇性培養(yǎng)基上篩查β-半乳糖苷酶陽(yáng)性菌，并提到“可選用市售商品化制品，以此計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)水中總大腸菌群”。大腸埃希氏菌是根據(jù)β-葡萄糖醛酸酶。檢測(cè)方法是兩類菌分開(kāi)論述的。而CCA顯色培養(yǎng)基可同時(shí)計(jì)數(shù)并鑒別這兩類菌，不可不謂具有更高的效率。

據(jù)悉，上海市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局已通知，將要更新發(fā)布《DB31/T 1091-2018 生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，2018年10月1日開(kāi)始實(shí)施。這雖然是地方性的條例，但畢竟對(duì)2006年的國(guó)標(biāo)進(jìn)行了一些改進(jìn)，估計(jì)可能會(huì)采納ISO9308-1.2014的方法。