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化學限定細胞培養(yǎng)基的優(yōu)化

2019-08-08 14:09來源:威正翔禹|締一生物


化學限定細胞培養(yǎng)基的優(yōu)化

——細胞體外培養(yǎng)方法中取代胎牛血清


作者:J. van der Valk, D. Brunner , K. De Smet, ?. Fex Svenningsen, P. Honegger, L. Knudsen, T. Lindl, J. Noraberg, A. Price, M.L. Scarino, G. Gstraunthaler


刊登于Toxicology in Vitro. 2010,24(4): 1053-1063



1. 背景


要使細胞存活更長時間或評估它的增殖、遷移和分化,一個基礎(chǔ)培養(yǎng)基肯定是不夠的,需要添加一些因子。血清是最常用的細胞維持和增殖的添加成分,特別是胎牛血清。然而,胎牛血清的使用也存爭議。一、使胎牛遭受痛苦。二、血清成分的批次波動。三、潛在的污染,如BSE,這使得動物源材料在新型生物藥的生產(chǎn)中被強烈排斥。事實上,在20%-50%的商品化FBS中存在病毒陽性。


以無血清培養(yǎng)基應(yīng)用為主要內(nèi)容的良好細胞培養(yǎng)實踐(Guidelines for Good Cell Culture Practice, GCCP)已發(fā)表。ECVAM科學建議委員會(ESAC)也發(fā)表了一個聲明,強烈建議使用無血清替代物。盡管實施GCCP還沒有形成法規(guī),但GCCP已成為GLP和GMP的一部分。


一個工作坊于2003年開始啟用,討論減少細胞和組織培養(yǎng)中FBS使用的可能性。本次會議的報告明確建議,減少或停止未出生的用于生產(chǎn)FBS的牛犢的痛苦。倫理、安全性和科學根據(jù)也在會上給出,用于替代細胞和組織培養(yǎng)方法中的FBS。2009年又開了一次工作坊,討論了無血清培養(yǎng)基的現(xiàn)狀。工作坊在丹麥哥本哈根舉行,是在歐洲體外毒理學會(ESTIV)、荷蘭-比利時體外方法學會(INVITROM)和丹麥體外毒理學網(wǎng)絡(luò)贊助下組織的。本次工作坊的結(jié)果清楚地顯示了是可以開發(fā)出一些不同原代細胞和組織以及細胞系的無動物成分培養(yǎng)基的。而且,該會還給出了指導(dǎo)意見,用于開發(fā)無血清、化學限定的哺乳動物細胞和組織培養(yǎng)基。



2. 無血清培養(yǎng)基的開發(fā)


無血清培養(yǎng)基的開發(fā)可追溯到1955年。早期嘗試是用無血清、激素補充的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,以了解血清在細胞培養(yǎng)基中的作用,并努力識別血清中所有與細胞增殖有關(guān)的生理成分,并用那些成分進行替代。該努力沒有成功。從那時起,幾種不同無血清制劑的配方已經(jīng)出來了,培養(yǎng)基補充了大約十個必要成分。其成功率為10-20%。1976年,G.佐藤進行了開創(chuàng)性的工作,開發(fā)出一個好的化學限定無血清培養(yǎng)基。他通過添加特定激素來替代血清,能促進細胞生長和分化。在最近10年里,對細胞功能的研究更為深入,已能鑒定出更多成分,加入到無血清培養(yǎng)基中使其性能更佳。許多轉(zhuǎn)化細胞或新轉(zhuǎn)染的細胞系可以成功地在這些無血清培養(yǎng)基中維持生長而無需適應(yīng)。并且細胞特異的培養(yǎng)基數(shù)量還在穩(wěn)步增長。現(xiàn)在,有超過一百種不同的無血清培養(yǎng)基配方已經(jīng)開發(fā)出來,并且可以購買使用,而無須自己開發(fā)。




2.1. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基


隨著時間的推移,很明顯幾乎每種類型細胞都有自己的營養(yǎng)需求,因此,廣譜的細胞無血清培養(yǎng)基幾乎不可能。不同類型細胞具有不同受體,參與細胞的生存、生長和分化,并釋放不同的因子到環(huán)境中去。由于開發(fā)新型的無血清培養(yǎng)基門檻較高,下面討論一些研發(fā)策略。


建議開始新配方時,使用DMEM和Ham's F12的50:50(v / v)混合物。該配方結(jié)合了DMEM的高氨基酸含量和Ham's F-12的高營養(yǎng)。此外,基礎(chǔ)培養(yǎng)基必須含有一種基礎(chǔ)成分,即ITS添加劑(胰島素,轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒)。胰島素,從1924年起,已是細胞培養(yǎng)中必不可少的,現(xiàn)在是培養(yǎng)基中最常用的激素。轉(zhuǎn)鐵蛋白也是一種培養(yǎng)基中的必需蛋白質(zhì),其主要作用是將鐵轉(zhuǎn)移到細胞中。硒是一種必需的微量元素,尤其在硒蛋白中起作用,它可以保護細胞免受氧化應(yīng)激。


2.2. 添加劑

盡管有些細胞類型可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中維持生長,但大多數(shù)細胞需要添加劑以存活、增殖或分化。大多數(shù)常見的添加成分如下:


2.2.1 激素

所有哺乳動物的激素都是血液循環(huán)中的生理成分。因此,它們也以不同的量存在于血清中。 因此,補充激素是開發(fā)無血清培養(yǎng)基的**步。胰島素在所有無血清培養(yǎng)基配方中都是必需的。 其他常用激素有糖皮質(zhì)激素(地塞米松、氫化可的松)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和能升高細胞內(nèi)cAMP的細胞特異性激素。水溶性甾體激素也可用。


2.2.2 生長因子

通常將生長因子添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以增加細胞增殖和刺激特定細胞功能。 傳統(tǒng)上,生長因子和其他補充劑是以胎牛血清(FBS)的形式添加。大多數(shù)生長因子是高度細胞特異性的,其他的則更廣譜,可以對幾種不同的細胞類型也有陽性效應(yīng)。FGF-2,例如,對無血清培養(yǎng)的軟骨細胞表型有陽性作用。培養(yǎng)的細胞有些可以釋放生長因子,刺激自身和其他細胞的增殖。


2.2.3 蛋白酶抑制劑


添加的FBS包含蛋白酶抑制劑,即α1-抗胰蛋白酶和α2-巨球蛋白。蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化,并且通過抑制細胞更新時偶爾釋放的溶酶體肽酶而對細胞有益,蛋白酶抑制劑對細胞具有保護作用,但不是必需的。當沒有提供蛋白酶抑制劑時,應(yīng)該仔細評估胰蛋白酶的濃度。



2.2.4蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物

蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用于提供氨基酸和短肽。這些不是細胞培養(yǎng)中必不可少的成分,其效果有爭議。事實上,一些研究報告蛋白水解產(chǎn)物對細胞培養(yǎng)的有益作用,其他一些研究證明蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物不支持細胞生長,而且更高的濃度會減少細胞生長。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物不是化學限定的成分,在可重復(fù)性和實驗的可比性上可能存在問題。



2.2.5剪切力保護劑

生物反應(yīng)器和灌注培養(yǎng)液中的湍流導(dǎo)致細胞的剪切應(yīng)力。 血清能保護細胞免受

這種剪切力損傷。 Pluronic F68具有類似的效果,但對于普通細胞培養(yǎng)不是必需的。


2.2.6 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是不同低分子量組分的載體,并且可以促進細胞黏附。 牛血清白蛋白通常用作脂質(zhì)載體。然而,BSA來自動物,可能受到污染或包含雜質(zhì)。 如今,可獲得重組蛋白,包括白蛋白用于無動物成分的細胞培養(yǎng)。


2.2.7 維生素

維生素由基礎(chǔ)培養(yǎng)基提供。至少有7種維生素對細胞生長和增殖至關(guān)重要:膽堿,葉酸,煙酰胺,泛酸,吡哆醛,核黃素和硫胺素。B族維生素是細胞生物化學所必需的,并且也存在于DMEM以及Ham F-12中。


2.2.8.氨基酸

培養(yǎng)哺乳動物細胞,至少13種氨基酸是必需的,即Arg,Cys,Gln,

His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Thr,Trp,Tyr,Val)并且在DMEM中以高濃度存在(0.5-4mM)。 7種非必需氨基酸(Ala,Asn,Asp,Glu,Gly,Pro,Ser)是在Ham's F-12中提供。


2.2.9谷氨酰胺

谷氨酰胺是蛋白質(zhì)和核糖核苷酸合成的必需前體。它也是用于細胞快速分裂和利用葡萄糖不佳的細胞的重要呼吸燃料。然而,谷氨酰胺也有它的缺點:在溶液中不穩(wěn)定,谷氨酰胺分解和代謝導(dǎo)致對細胞有毒的氨的產(chǎn)生和積累,因為氨不被無血清和/或無蛋白培養(yǎng)基中的血清蛋白所吸附。要克服這些缺點,人們又開發(fā)了在培養(yǎng)基中使用谷氨酰胺的替代方案。例如,在表達足量谷氨酰胺合成酶的細胞中,谷氨酸可以代替谷氨酰胺。最近的一項發(fā)明是使用含有谷氨酰胺的二肽,即丙氨酰-谷氨酰胺和甘氨酰-谷氨酰胺,商品名為GLUTAMAX?。這些二肽更穩(wěn)定

和耐熱,甚至可以對含有這些物質(zhì)的培養(yǎng)基進行高壓滅菌。二肽被細胞內(nèi)或細胞外的肽酶裂解,從而釋放谷氨酰胺和丙氨酸或甘氨酸。因此,谷氨酰胺的可獲得性取決于肽酶活性,這導(dǎo)致較低速率的的谷氨酰胺消耗和氨生產(chǎn)。 GLUTAMAX?可以1:1的摩爾濃度代替谷氨酰胺。


2.2.10微量元素

大多數(shù)微量元素都可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中獲得。Ham's F-12富含必要的微量元素。


2.2.11 脂類

脂肪酸和脂質(zhì)在細胞培養(yǎng)中的作用長期以來被忽視。脂質(zhì)可作為能量儲備,作為細胞膜的結(jié)構(gòu)成分,以及在運輸和信號傳導(dǎo)中扮演角色。 一些脂質(zhì)可在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中獲得。但是,建議必需脂肪酸和乙醇胺為添加劑。水溶性添加劑可商品化獲得。血清白蛋白是脂肪酸和脂質(zhì)的載體。必需脂肪酸是幾種無血清培養(yǎng)基配方的組分。


2.2.12 抗生素

應(yīng)盡可能避免使用抗生素。可能會產(chǎn)生耐抗生素的微生物,抗生素對細胞生長和功能也可能有不良影響。


2.2.13黏附因子

大多數(shù)哺乳動物細胞需要用于細胞粘附的特殊的培養(yǎng)基質(zhì)才能在體外存活和生長。塑料培養(yǎng)皿,經(jīng)過特殊處理后在聚苯乙烯表面引入電荷和親水性,例如多聚L(或D)-賴氨酸或鳥氨酸,是最常用的細胞黏附基質(zhì)。培養(yǎng)平皿上包被其他基質(zhì)如細胞外基質(zhì)成分或膠原蛋白基質(zhì),可進一步促進貼壁細胞的黏附。


2.2.14滲透壓

盡管哺乳動物細胞表現(xiàn)出對滲透壓一定的耐受,滲透壓仍應(yīng)始終仔細檢查,并且

在適應(yīng)新的細胞基配方時,應(yīng)對滲透壓進行補償。


2.3 開發(fā)一種無血清培養(yǎng)基


如上所示,要從細胞和組織培養(yǎng)基中去除FBS,并仍然保持細胞粘附、生長和增殖,很重要的是要包括幾種細胞培養(yǎng)基中的組分(需大量)。圖中1顯示的是一個“培養(yǎng)基金字塔”。金字塔的底部為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,包括DMEM / Ham's F-12(50:50,v/v),添加有胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)。要使貼壁細胞黏附在培養(yǎng)容器底物,應(yīng)考慮包被細胞外基質(zhì)的成分。細胞無血清培養(yǎng)通常需要細胞黏附因子。


培養(yǎng)基配方開發(fā)的下一步是添加特定的激素和生長因子。表皮生長因子(EGF)和糖皮質(zhì)激素(氫化可的松、地塞米松)應(yīng)在大多數(shù)培養(yǎng)基中存在。根據(jù)細胞類型,還可能需要額外的細胞特異性生長因子,例如神經(jīng)元所需的神經(jīng)生長因子(NGF)。已經(jīng)證明上皮細胞培養(yǎng)時需要添加升高細胞內(nèi)cAMP水平激動劑。在這方面,毛喉素和霍亂毒素,盡管是強藥劑,被用作體外有絲分裂原。


金字塔頂端代表無血清培養(yǎng)基成分的特異性增加:即添加有脂質(zhì),抗氧化劑和/或特定維生素。維甲酸(維生素A)是一些上皮類型細胞所需的添加劑。維生素E(α-生育酚)和抗壞血酸(維生素C)被看作抗氧化劑。其他無血清培養(yǎng)基中的抗氧化劑有β-巰基乙醇(β-ME)和硒(見上文)。



圖1. 開發(fā)無血清培養(yǎng)基的金字塔




2.4 細胞系對無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)

有如下幾種方法:

1. 逐步減少血清用量,直到血清比例為0.1%

2. 含血清培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基比例的變化

3. 和方法2相似,只不過采用比例逐漸降低的條件培養(yǎng)基

4. 接種的細胞已實現(xiàn)馴化好


3. 促進無血清培養(yǎng)基的開發(fā)和應(yīng)用

3.1 信息來源

在自我開發(fā)之前,應(yīng)先查查數(shù)據(jù)庫,是是否有已經(jīng)開發(fā)好的。市面上現(xiàn)已有450種不同無血清培養(yǎng)基,但只針對有限的細胞類型。


3.2 無血清培養(yǎng)基互動在線數(shù)據(jù)庫


3.3 驗證新的培養(yǎng)基和適應(yīng)的細胞

在關(guān)于使用FBS和其他動物源性添加劑的聲明中(ESAC,2008),ECVAM科學咨詢委員會強烈主張開發(fā)新的無血清體外培養(yǎng)方法。此外,如體外使用含血清的培養(yǎng)方法,將培養(yǎng)基提交給ECVAM進行驗證,必須提供使用血清的理由。

為了促進無血清培養(yǎng)基的使用,ECVAM(替代方法的歐洲驗證中心)將鼓勵無血清培養(yǎng)體系驗證的提交者公開他們的無血清方案。已有的替代動物成分的培養(yǎng)方法,應(yīng)同含血清的培養(yǎng)基進行比較,確保觀察終點不受影響。


ECVAM網(wǎng)站 (http://ecvam.jrc.ec.europa.eu)有一個關(guān)于無血清培養(yǎng)基的公開論壇。


3.4 其他活動

希望優(yōu)先使用無血清培養(yǎng)基的資助機構(gòu)可以提供促進FBS替代品的激勵措施。關(guān)于體外培養(yǎng)和工藝的研討會和會議,還應(yīng)鼓勵開展特定研討會和海報,交流與無血清培養(yǎng)基有關(guān)的經(jīng)驗。研討會可以由細胞和組織培養(yǎng)學會(例如ESTIV)的工作組籌備。此外,應(yīng)開展無血清細胞和組織培養(yǎng)價值的教育,他們也是基礎(chǔ)培養(yǎng)技術(shù)教育和培訓(xùn)的一部分。


支持協(xié)調(diào)行動,促進與特定細胞和組織培養(yǎng)相關(guān)的信息交流,可以在國家,歐洲和國際層面進行。


4. 無血清研究舉例

4.1 血小板裂解物

下面報道了使用人血小板裂解物(PL)作為血清替代物。PL是由保存的人供體血小板濃縮物制備。在低滲鹽水中凍融可實現(xiàn)血小板的**活化。血小板顆粒生長因子的釋放程度可通過ELISA和Western Blotting測定。PL的生長促進能力和促有絲分裂能力,可在眾多有選擇的連續(xù)細胞系上進行測試,這些細胞系的生長特征、表型和分化終點應(yīng)已很好地確定。 PL+DMEM支持細胞的生長、增殖和分化,通過穹頂形成評估近端小管樣LLC-PK 1(豬腎)和HK-2(人腎)細胞,而遠端小管樣MDCK(狗腎)細胞在血小板提取物添加的無血清DMEM / Ham-F-12中生長良好。除貼壁上皮細胞系外,不依賴貼壁的Raji人淋巴瘤細胞也進行了研究。 PL完全支持懸浮Raji細胞的生長和增殖。在所有細胞系中,監(jiān)測增殖是通過確定上皮培養(yǎng)物的細胞密度(每個生長區(qū)域的細胞數(shù))來確定,以及刃天青或WST-8測定。生長率和增殖率在含10%FBS或5%PL的培養(yǎng)基條件下,二者相當。為了確定PL的促增殖潛力,細胞外MAPK(ERK1 / 2)的刺激進行了檢測。GR激活MAPK信號通路,使下游ERK1/2磷酸化。將PL添加到靜止狀態(tài)的LLC-PK1培養(yǎng)物中,幾分鐘內(nèi)即可發(fā)生ERK1/2的磷酸化和激活。FBS對應(yīng)的ERK1/2活化的時程相同。數(shù)據(jù)顯示,在哺乳動物細胞和組織培養(yǎng)中,PL替代FBS是有價值的,具有高潛力。


4.2無血清聚集腦細胞培養(yǎng)物

涉及腦細胞的3D培養(yǎng),這里略。


4.3器官型腦切片培養(yǎng)和化學限定的無血清培養(yǎng)基 Neurobasal與B27

器官型腦切片培養(yǎng)可以生長數(shù)周和數(shù)月,保留其基礎(chǔ)細胞結(jié)構(gòu)、組成和連接,并越來越多地用作研究神經(jīng)退行性疾病機理和治療的模型。在1990年代中期,含25%馬血清的Optimem培養(yǎng)基被無血清的Neurobasal和B27添加劑所替代。

細胞起始是在Serum Optimem培養(yǎng)2天,之后即用無血清培養(yǎng),旨在避免未知生長因子和血清批間差異的影響。含B27的Neurobasal的使用效果很好,直到2000年初發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物種的壞死洞。2010年,一個美國小組公布了N21的配方,它是對B27配方的優(yōu)化。Sigma-Aldrich也在2010年初推出一系列神經(jīng)元和干細胞的完全培養(yǎng)基,Stemline TM,其中包含了所有必需的添加劑,可和Serum Optimem進行比較。


4.4 化學限定培養(yǎng)基和血清培養(yǎng)基有時誘導(dǎo)細胞采用不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行增殖

含B27的Neurobasal培養(yǎng)基為化學限定培養(yǎng)基,可長期培養(yǎng)神經(jīng)元,而成纖維細胞或星型細胞不過度生長。然而,采用該培養(yǎng)基原代培養(yǎng)有時會產(chǎn)生不一致的結(jié)果。例如,一些膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元生長所采用的信號通路,會與在血清培養(yǎng)基中生長不一樣。


4.5 人小腸細胞Caco-2在無血清培養(yǎng)基中功能分化所需培養(yǎng)條件的優(yōu)化

雖然人Caco-2細胞系代表了**和最廣泛使用的可吸收腸道細胞模型,該細胞分化功能仍顯示出高度的異質(zhì)性,這主要由于培養(yǎng)流程的不同。胎牛血清(FBS)是產(chǎn)生變異的重要來源。因此多年來已經(jīng)使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)這些細胞。Halleux和Schneider于1991年開發(fā)出一種用于Caco-2細胞的無血清培養(yǎng)基,它改進自肝細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基,添加有胰島素,表皮生長因子,白蛋白-亞麻酸,氫化可的松和三碘甲狀腺原氨酸(T3)。細胞生長在包被有膠原蛋白的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)濾膜上,作為腸道屏障的模型。并在培養(yǎng)15天后顯示出腸細胞的許多分化功能,正確的極化和細胞側(cè)壁通透性的降低,表明建立了有正常功能的緊密連接。不久之后,Jumarie和Malo獲得了接種在塑料基質(zhì)上、采用ITS添加的DMEM培養(yǎng)的分化的Caco-2細胞。該限定培養(yǎng)基可是使細胞3周后正常分化,僅有蔗糖酶活性低于血清培養(yǎng)的細胞,但可加入T3提高其活性。

一種包含ITS和脂質(zhì)的無血清培養(yǎng)基被用于分化Caco-2細胞。為提高該培養(yǎng)基性能,試驗了一些不同的添加劑,(A)胰島素,轉(zhuǎn)鐵蛋白,硒(ITS)和脂質(zhì)混合物(油酸鹽,棕櫚酸鹽,膽固醇和BSA作為載體); (B)來自ITS的生長因子和激素的成分限定的混合物。


5.結(jié)論

使用血清培養(yǎng)細胞和組織是有問題的,它同時存在有倫理和科學的原因。因而推薦使用無血清培養(yǎng)基,并且**是無動物成分和化學限定的培養(yǎng)基。


因此建議采用"不,除非”的原則,即不使用血清,除非還沒開發(fā)出無血清培養(yǎng)基。開發(fā)無血清培養(yǎng)基,一些成分是必需的哦,另一些則是有用的。而且采用了一些方法使細胞適應(yīng)新的無血清培養(yǎng)基。


對于新的血清的驗證要注意,應(yīng)使原先研究的標志物在細胞和組織上仍然表達。現(xiàn)在已經(jīng)有了成功地開發(fā)無血清培養(yǎng)基的方法,文中的模型顯示,開發(fā)并不是一項容易的任務(wù),還存在一些問題。通過數(shù)據(jù)庫、會議和網(wǎng)絡(luò)寫作,廣泛的交流有助于開發(fā)出新的無血清培養(yǎng)基配方。


附錄

開發(fā)無血清培養(yǎng)基的建議


1.開發(fā)無FBS培養(yǎng)基時,從適當?shù)幕A(chǔ)培養(yǎng)基開始。50:50(v/v)DMEM和Ham's F-12和ITS是一些研究成功的選擇。


2.當使用谷氨酰胺時,應(yīng)加入濃度為2-4mM的谷氨酰胺。也對于一些細胞系,也可以添加Glutamax I TM(L-Ala-L-Gln)。


3.必要時補充細胞類型特異性的生長因子,激素,維生素,微量元素和脂質(zhì)。


4.注意滲透壓。


5.對于某些研究或細胞類型,可以添加特定蛋白質(zhì)。


6.有些必需脂肪酸,不存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,可能需要添加。


7.**不使用抗生素。


8.對于一些細胞類型和原代培養(yǎng),可以使用黏附基質(zhì)。許多無血清配方需要預(yù)先包被培養(yǎng)皿。


9.對于生物反應(yīng)器和灌注培養(yǎng),可以添加剪切力保護劑(Pluronics F68)。


10.細胞馴化應(yīng)小心進行。


11.始終檢查細胞的性能是否發(fā)生了變化,以及研究終點是否受到影響。


12.成功后,與同事和通過現(xiàn)有細胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)庫分享你的配方。