納米顆粒實(shí)現(xiàn)器官特異性基因編輯

含遺傳藥物的脂質(zhì)納米粒可以通過(guò)生物工程調(diào)整其生物分布，誘導(dǎo)器官特異性基因調(diào)控。

脂質(zhì)納米顆粒(LNP)技術(shù)使一種小干擾siRNA (siRNA)藥物的臨床轉(zhuǎn)化和**獲得美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)的批準(zhǔn)成為可能。該納米藥物是為治療遺傳性疾病轉(zhuǎn)胸腺視蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性引起的多神經(jīng)病而開(kāi)發(fā)的，它依賴(lài)于高效的lnp介導(dǎo)的siRNA在靜脈滴注后傳遞到肝細(xì)胞，從而抑制病理蛋白的產(chǎn)生。LNP系統(tǒng)還允許信使RNA (mRNA)的包封，以誘導(dǎo)治療性蛋白的產(chǎn)生，并允許基因編輯復(fù)合物全身給藥后糾正肝細(xì)胞中的致病突變。然而，在肝臟以外的組織和器官中實(shí)現(xiàn)治療相關(guān)的基因調(diào)控仍是一個(gè)未解之謎。

在最新一期Nature Nanotechnology上，Qiang Cheng等人提出了一種稱(chēng)為選擇性器官靶向(SORT)的方法，通過(guò)生物工程將含有核酸療法的LNPs誘導(dǎo)肝臟、脾臟和肺特異性基因調(diào)控。LNP系統(tǒng)通常由磷脂、膽固醇、聚乙二醇(PEG)脂質(zhì)和可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)組成。每個(gè)LNP成分及其摩爾比都已被優(yōu)化，以確保高效的核酸遞送到肝細(xì)胞。特別是，合理設(shè)計(jì)和篩選可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)(或類(lèi)脂質(zhì))文庫(kù)對(duì)于實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用相關(guān)劑量的肝基因沉默至關(guān)重要。最有效的電離陽(yáng)離子脂質(zhì)，其特征是明顯的pKa值在6.2和6.5之間，具有三種功能：(1)在LNP生產(chǎn)期間，酸性pH值下質(zhì)子化的叔胺脂質(zhì)頭部促進(jìn)其與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合，(2)在生理的pH值，附近無(wú)電荷的脂質(zhì)確保凈中性表面電荷，以減少免疫反應(yīng)和循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)和(3)細(xì)胞攝取后進(jìn)入酸化的內(nèi)體中，正電荷脂質(zhì)促進(jìn)膜融合和有效的胞質(zhì)遞送。

在這種SORT方法中，作者添加五分之一脂質(zhì)成分來(lái)通過(guò)靜脈注射遞送功能信使核糖核酸或基因編輯復(fù)合物道特定組織。使用一個(gè)快速的混合過(guò)程，這種SORT脂質(zhì) (**的陽(yáng)離子和陰離子或可質(zhì)子化的陽(yáng)離子)和不同摩爾比的其他材料生成一個(gè)脂質(zhì)體文庫(kù)，包載mRNA編碼熒光素酶進(jìn)行體內(nèi)篩選。通過(guò)增加**性陽(yáng)離子脂質(zhì)1，2-二烯烴-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)的摩爾百分比(0-100%)，可使熒光素酶的表達(dá)在靜脈注射后從肝臟轉(zhuǎn)移到脾臟和肺。LNPs中加入10-40%的**性陰離子脂質(zhì)1，2-二烯醇化酶-sn-甘油-3-磷酸(18PA)可在脾臟中特異性表達(dá)熒光素酶。加入20%的其他可電離的陽(yáng)離子脂類(lèi)，如1，2-二烯酰-3-二甲基氨基甲烷-丙烷(DODAP)，不會(huì)改變生物分布，但增加了mRNA對(duì)肝臟的遞送。該方法的普遍性通過(guò)將LNP與其他**性帶電或可電離的陽(yáng)離子脂類(lèi)功能化而得到證實(shí)，這導(dǎo)致了器官表達(dá)的類(lèi)似變化，且表現(xiàn)出與脂類(lèi)相關(guān)的方式。值得注意的是，SORT-LNP的療效離不開(kāi)可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)包合。給予肺、脾臟和肝臟特異性mRNA SORT-LNP的篩選結(jié)果表明，基于熒光素酶的篩選可產(chǎn)生持續(xù)的治療性蛋白，且無(wú)明顯毒性。重要的是，SORT方法還允許調(diào)節(jié)LNPs組織特異性熒光素酶的表達(dá)，使其與臨床批準(zhǔn)的Onpattro配方相同。

Cheng等人也報(bào)道了使用SORT-LNPs進(jìn)行組織特異性CRISPR/Cas基因編輯。相對(duì)于治療性基因沉默或表達(dá)，基于CRISPR/Cas的基因編輯需要(至少)兩個(gè)組成部分：引導(dǎo)RNA (guide RNA， gRNA)識(shí)別目標(biāo)DNA和Cas核酸酶進(jìn)行雙鏈斷裂。作者生成了包含gRNA和Cas9 mRNA或gRNA/Cas9核糖核酸蛋白復(fù)合物的SORT-LNPs，并在肝外組織中進(jìn)行了基因編輯。在紅色熒光蛋白tdTomato報(bào)告小鼠中，不同種類(lèi)的LNP劑型可選擇性誘導(dǎo)肝、肺、脾特異性基因編輯。此外，作者還展示了內(nèi)源性靶基因(PTEN)和治療性靶基因(PCSK9)的組織特異性編輯。

Cheng等人的研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)是在復(fù)雜的報(bào)告模型中采用了系統(tǒng)的LNP篩選方法。Sago等人報(bào)道了一種類(lèi)似的方法，稱(chēng)為納米顆粒傳遞的快速識(shí)別(FIND)。他們的策略包括篩選數(shù)百個(gè)LNPs，以確定使用合理設(shè)計(jì)的DNA條形碼將功能性mRNA(和其他RNA療法)遞送到各種組織的有效配方。

LNP技術(shù)可以直接在特定組織(和細(xì)胞)中實(shí)現(xiàn)治療性基因調(diào)控的前提是令人興奮的，因?yàn)樗赡軙?huì)使器官特異性基因治療成為可能，用于治療囊性纖維化(肺)、淋巴瘤(脾)或免疫紊亂。雖然作者推測(cè)了明顯的pKa值改變和獨(dú)特的蛋白冠，但需要精確的機(jī)制研究來(lái)揭示SORT修飾如何將LNPs重定向到特定的組織。根據(jù)這一思路，先前有報(bào)道稱(chēng)調(diào)節(jié)mRNA脂質(zhì)復(fù)合物的凈電荷可以調(diào)控組織特異性抗原提呈細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)。系統(tǒng)給藥后，陽(yáng)性mRNA脂質(zhì)復(fù)合物主要在肺組織中表達(dá)，而降低陽(yáng)離子脂質(zhì)含量則使其表達(dá)轉(zhuǎn)移至脾臟。進(jìn)一步研究LNP的器官和組織特異性使得進(jìn)一步微調(diào)成為可能。然而，可能的免疫原性和輸液相關(guān)的影響需要深入研究，然后才能實(shí)現(xiàn)SORT方法，以合理設(shè)計(jì)用于治療性基因修飾肝臟以外器官的LNP轉(zhuǎn)化配方。