干貨分享：細胞轉(zhuǎn)染全攻略(下)

不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉(zhuǎn)染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。

每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇最適合實驗設計的轉(zhuǎn)染試劑。當然，最適合的是高效、低毒、方便、廉價的轉(zhuǎn)染試劑。

一般低的細胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變。最適合轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。

細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導致和轉(zhuǎn)染相關的細胞行為的變化。也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學性狀發(fā)生不同程度的改變，導致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。

因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復**結果。

轉(zhuǎn)染時應根據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法進行，但也要根據(jù)實驗室的條件來確定**轉(zhuǎn)染條件。
（1）細胞培養(yǎng)物

推薦在轉(zhuǎn)染前24小時分細胞，這將提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細菌，支原體或真菌的污染。

（2）細胞密度
細胞密度對轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。如果選用新的細胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，**能夠進行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法，包括適當?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等。

（3）血清
對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率。

不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的。

胎牛血清經(jīng)常用到，便宜一點的有馬或牛血清。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細胞生長，因此也會影響轉(zhuǎn)染效率。新加培養(yǎng)基的預熱對細胞轉(zhuǎn)染很有幫助。

（4）氮磷（N/P）比
N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關鍵（為了換算方便，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示），在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高，之后達到平值，但毒性也隨之而增加，因此在實驗之前應根據(jù)推薦比例，確定本實驗的**轉(zhuǎn)染比例。
（5）DNA質(zhì)量
DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。應盡可能提高DNA的純度。

轉(zhuǎn)染載體的構建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結果。

病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。

除載體構建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行，因此選擇組成或可調(diào)控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾。